产麦角硫因的大肠杆菌的构建方法与流程

本发明属于基因工程领域，涉及一种麦角硫因生产菌的构建方法，具体涉及一种构建产麦角硫因的大肠杆菌工程菌的方法。

背景技术：

1、麦角硫因(l-ergothionine，egt)，化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐，是至今发现的唯一天然的2-硫代咪唑氨基酸。由于麦角硫因具有特殊的硫酮结构和较高的氧化还原电势，因此是一种天然的抗氧化剂。自然状态下，麦角硫因主要以硫酮的形式存在，相较其他抗氧化剂更不易发生自氧化反应，具有更高的稳定性，是一种比辅酶q10或艾地苯醌更强大的抗氧化剂。作为一种强力抗氧化剂，其抗氧化功能主要体现在延缓人体细胞的衰老速度上，提高皮肤细胞的活性，防止皮肤的光老化，减少黑色素生成和亮肤的效果，因此麦角硫因作为一种多功能的细胞生理保护剂被广泛用于化妆品、美容产品、食品、饮料和保健品等健康保健领域。

2、麦角硫因的制备包括化学合成法和生物合成法。化学合成方法工艺复杂，合成过程容易导致局部或全部手性消旋化，产品收率低，且合成的试剂昂贵，导致产品成本高，难以大范围推广使用。生物合成法分两种，一种是蕈菌菌丝深层发酵法，另一种是基因工程菌生物催化合成法。蕈菌菌丝深层发酵指的是以蕈菌菌丝体发酵制备l-麦角硫因，发酵成本低，易于规模化，但是麦角硫因的产量低，且发酵过程副产物较多、难提纯，因此也无法规模化制备出高纯度麦角硫因。例如，cn102978121a公开了食用菌白香蘑菌催化组氨酸底物生成麦角硫因，底物转化率可达70％，未报道产物产率；cn103184246a公开了大型丝状真菌花脸香蘑摇瓶发酵10天，麦角硫因产量51mg/l；wo2015180492a1公开了糙皮侧耳在75l发酵罐中经14天发酵，麦角硫因产量352mg/l；cn103734022a公开了食用菌糙皮侧耳经7～15天发酵，麦角硫因产量最高产量143.7mg/l。

3、基因工程菌生物催化合成法是当下麦角硫因的重点研发方向，以基因工程菌催化l-组氨酸、l-半胱氨酸催化合成l-麦角硫因合成，发酵成本低，提取工艺相对简单，易于规模化，具有工业化应用潜力。例如，wo2017150304a1公开了青紫链霉菌streptomyceslividans经7天发酵，麦角硫因产量900mg/l；cn107250347a公开了基因工程曲霉经基因工程改造后，发酵产量可达438mg/l；大肠杆菌经基因工程改造，异源表达分枝杆菌的麦角硫因基因合成簇，麦角硫因产量640mg/l；cn106661585a公开了大肠杆菌经基因工程改造，发酵麦角硫因产量12mg/l；cn201910664772.8a公开了以枯草芽孢杆菌168为宿主表达外源基因，构建的基因工程菌麦角硫因产量达到568.4mg/l；cn111534535a公开了以圆红酵母为宿主表达外源基因，工程菌发酵麦角硫因产量达到1.5g/l。

技术实现思路

1、由于大肠杆菌是增殖速度最快的微生物之一，也是基因工程领域应用最广的模式菌，因此开发产麦角硫因的大肠杆菌工程菌将会促进工程菌发酵生产麦角硫因方法的工业化应用。发明人探索了大肠杆菌工程菌的构建，改变大肠杆菌bw25113的代谢途径，并对于麦角硫因合成的相关蛋白(包括酶和转运蛋白)/基因簇进行了广泛筛选和实验对比，通过结合链孢霉neurospora sp.来源的麦角硫因合成酶1(nsegt1，genbank登录号：kaj4380386.1)与粗糙链孢霉neurospora crassa来源的麦角硫因合成酶2(ncegt2，ncbi登录号：xp_001728131.1)的两酶组合，终于实现了麦角硫因的表达。另一方面，为了提高大肠杆菌工程菌的麦角硫因表达水平，还通过针对甲基转移酶功能区的定向突变技术对麦角硫因合成酶1(nsegt1)和/或麦角硫因合成酶2(ncegt2)进行改造，获得了促进麦角硫因合成的酶突变体和大肠杆菌工程菌。具体地，本发明包括如下技术方案：

2、一种构建产麦角硫因的大肠杆菌的方法，包括下述步骤：

3、a.以大肠杆菌bw25113、mg1655或w3110为底盘菌，优选大肠杆菌bw25113为底盘菌，敲除或者弱化l-半胱氨酸降解途径，得到菌株a；

4、b.使菌株a过表达链孢霉(neurospora sp.)来源的麦角硫因合成酶1(nsegt1，genbank登录号：kaj4380386.1，氨基酸序列如seq id no:2所示)或者其突变体(氨基酸序列如seq id no:6所示)以及粗糙链孢霉(neurospora crassa)来源的麦角硫因合成酶2(ncegt2，ncbi登录号：xp_001728131.1，氨基酸序列如seq id no:4所示)，筛选阳性克隆，得到产麦角硫因的大肠杆菌工程菌。

5、在一种实施方式中，上述步骤a是敲除ygea基因(ncbi登录号：gi:446771403)和ssea基因(ncbi登录号：gi:446030771)，获得bw25113-δys宿主菌a。

6、可选地，所述ygea基因和ssea基因的敲除可以采用crispr-cas9基因编辑技术进行。

7、上述步骤b可以是将neurospora sp.来源的麦角硫因合成酶1(nsegt1，genbank登录号：kaj4380386.1，氨基酸序列如seq id no:2所示)或者其突变体(氨基酸序列如seq idno:6所示)的表达质粒、neurospora crassa来源的麦角硫因合成酶2(ncegt2，ncbi登录号：xp_001728131.1，氨基酸序列如seq id no:4所示)的表达质粒转化入菌株a感受态细胞中。

8、在一种可选的实施方式中，上述步骤b可以是将链孢霉(neurospora sp.)来源的麦角硫因合成酶1(nsegt1，genbank登录号：kaj4380386.1)基因或者其突变体基因与粗糙链孢霉(neurospora crassa)来源的麦角硫因合成酶2(ncegt2，ncbi登录号：xp_001728131.1)基因一起克隆入大肠杆菌基因组中。

9、优选地，所述麦角硫因合成酶1(nsegt1，genbank登录号：kaj4380386.1，氨基酸序列如seq id no:2所示)的编码基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述麦角硫因合成酶1突变体(氨基酸序列如seq id no:6所示)的编码基因的核苷酸序列如seq id no:5所示；所述麦角硫因合成酶2(ncegt2，ncbi登录号：xp_001728131.1，氨基酸序列如seq idno:4所示)的编码基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。

10、当使用质粒表达上述nsegt1和ncegt2时，上述麦角硫因合成酶1即nsegt1或其突变体的编码基因和所述麦角硫因合成酶2即ncegt2的编码基因被克隆在同一个质粒上进行共表达。

11、可选地，上述质粒中，麦角硫因合成酶1即nsegt1或其突变体的编码基因和所述麦角硫因合成酶2即ncegt2的编码基因分别置于trc启动子调控下。

12、上述质粒载体可以是任何适合于在大肠杆菌中表达的质粒，例如可以是pet载体pet22b、pet24a、pet28a等，psh，ptrc99a，petduet 1，prsfduet 1质粒等等。

13、在一种实施方式中，上述的共表达质粒是用ptrc99a质粒做骨架载体，trc启动子作为基因表达的启动子，通过基因片段重组的方式构建含有nsegt1/突变体和ncegt2的共表达质粒ptrc99a-trc-nsegt1/突变体-trc-ncegt2。

14、本发明的第二个方面提供了一种麦角硫因合成酶突变体，其可以具有如seq idno:6所示的氨基酸序列，本文中可命名为nsegt1mut，其为nsegt1的(e88g、k239s、v316a)突变体。应理解，上述麦角硫因合成酶1突变体并不限于氨基酸序列为seq id no:6的突变体nsegt1mut，还包括氨基酸序列与seq id no:6有85％以上、优选90％以上、优选95％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且酶活力相比seq id no:6提高的多肽。

15、本发明的第三个方面提供了编码上述麦角硫因合成酶突变体nsegt1mut的基因。

16、例如，上述nsegt1mut编码基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。

17、本发明的第四个方面提供了上述的麦角硫因合成酶突变体nsegt1mut或者上述的基因例如seq id no:6在促进微生物生产麦角硫因中的应用；或者提供了上述的麦角硫因合成酶突变体nsegt1mut在酶促合成麦角硫因中的应用。

18、本发明的第五个方面提供了一种麦角硫因生产菌，其通过上述的方法构建得到。

19、本发明的另一个方面提供了上述麦角硫因生产菌在发酵法生产麦角硫因中的用途。

20、在一种实施方式中，由于在麦角硫因的好氧生物合成途径和厌氧生物合成途径中，组氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸是合成麦角硫因的前体，因此发酵培养基中可添加有l-组氨酸，并且还可以添加有l-甲硫氨酸和/或l-半胱氨酸。

21、在上述麦角硫因生产菌发酵后，从发酵液中提取产物麦角硫因，无需对发酵菌体进行破胞处理，有助于降低生产成本。

22、本发明通过基因工程手段构建出生产麦角硫因的大肠杆菌工程菌株；并且通过针对nsegt1甲基转移酶功能区的定向突变技术获得了可提高大肠杆菌表达麦角硫因水平的麦角硫因合成酶1突变体nsegt1mut，使得l-组氨酸转化率和麦角硫因生成率有效地提高，麦角硫因的产量提升了3.1倍，高达5g/l，为大肠杆菌发酵法生产麦角硫因开辟了一种新途径。