来源于乳铁蛋白的抗菌肽及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及来源于乳铁蛋白的抗菌肽及其应用。

背景技术：

1、抗生素的耐药性已成为影响抗感染治疗和畜牧业发展的严重问题，新的抗菌物质的研究和开发是解决这一问题的关键。为保障人与动物的健康，可使用抗生素替代物。抗菌肽以其广谱高效的抗细菌、真菌、病毒、寄生虫、肿瘤作用,且无残留、不易产生耐药性,同时能够促进伤口愈合及血管新生，被认为是抗生素的最佳替代物(fischbach m a,walsh ct.antibiotics for emerging pathogens[j].science,2009,325(5944):1089-1093.)。抗菌肽也称宿主防御肽或肽抗生素，广泛存在于自然界，是天然免疫系统的重要组成部分，近年来成为国际生命科学领域研究的热点之一(李杰，杭柏林，秦爱建,等.牛血红蛋白源抗菌肽p3及其类似肽的生物信息学分析[j].中国畜牧兽医,2017,44(1):59-64.)。目前大量天然来源或人工合成的抗菌肽正被进行广泛深入的研究，截至2022年5月，已有3000多种抗菌肽被收录至抗菌肽数据库(https://aps.unmc.edu)中(张书会，罗璐，孙雪言，等.虎奶菇菌丝体抗菌肽提取工艺优化及活性研究[j].食品与机械,2022,38(08):158-165.&browne k,chakraborty s,chen r,et al.a new era of antibiotics:the clinical potential ofantimicrobial peptides[j].international journal of molecular sciences,2020,21(19):7047.)。

2、传统抗菌肽多数是从微生物或动植物体内分离得到，分离过程操作繁琐、流程长、周期长、成本高、风险高，在随机筛选过程中带有很大的盲目性，且容易使一些抗菌肽的活性受到影响。如何高效的发现更多的高活性、高稳定性和低毒性的抗菌肽也是目前研究的热点之一。而通过半理性设计获得的多肽的蛋白来源不明确，后续的应用需要解决其安全性问题。随着对抗菌肽活性和相关理化性质的研究不断积累以及生物信息学技术的发展，仍然需要研发更新、更具应用价值的广谱抗菌多肽。

3、乳铁蛋白(lactoferrin，lf)是一种多功能铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族。它大量存在于牛奶中，是人类外分泌物中的一种主要蛋白质，具有多种生物活性(fernandesk e,carter d a.the antifungal activity of lactoferrin and its derivedpeptides:mechanisms of action and synergy with drugs against fungal pathogens[j].frontiers in microbiology,2017,8:2.)。lf不仅具有广谱抗菌、抗炎症、调节机体免疫等多种功能，而且天然、无毒。来自牛乳的乳铁蛋白(bovine lactoferrin,blf)容易获取，适合大规模生产，且不存在伦理道德问题，具有更好的临床应用意义。目前商业中使用的乳铁蛋白大多来源于牛乳，每毫升牛乳中能提取0.23mg乳铁蛋白，纯度为95％(杨安树,高金燕,李欣,等.牛乳中乳铁蛋白的分离纯化研究[j].食品科技,2005(3):17-19.)。2015年，欧盟食品安全局(efsa)批准牛乳铁蛋白作为新型食品配料(王楠楠,蔡婷婷,朱婉萍.乳铁蛋白抗菌作用研究进展[j].食品科技,2020,45(08):233-237.)。除了是一种活性的完整蛋白外，lf还是多种蛋白水解酶从多肽链上切割出来的抗菌肽的丰富来源(sinha m,kaushik s,kaur p,et al.antimicrobial lactoferrin peptides:the hidden playersin the protective function of amultifunctional protein[j].internationaljournal of peptides,2013,2013.)，甚至许多已被证明具有超过整个lf的抗菌活性(fernandes k e,payne r j,carter d a.lactoferrin-derived peptide lactofunginis potently synergistic with amphotericin b[j].antimicrobial agents andchemotherapy,2020,64(10):e00842-20.)，然而其抗菌肽的获取途径有限，且制备工艺复杂。随着生物信息学分析和大数据分析技术的发展，通过半理性设计获得的抗菌肽的蛋白来源不明，其后续应用考虑到安全性问题，因此本发明通过对乳铁蛋白序列和功能进行深度挖掘以获得新的潜在抗菌活性肽。到目前为止，尚未见到以乳铁蛋白序列为基础全序列建立重叠肽库直接进行分析得到的抗菌肽。

技术实现思路

1、本发明采用生物信息学的方法，基于重叠肽库设计乳铁蛋白肽文库，借助antimicrobial peptide scanner vr.2服务器预测和筛选评分较高的抗菌肽，可作添加剂在食品、保健品、化妆品或医药领域得到广泛的应用。

2、本发明解决目前通过天然成分分离提取抗菌肽成本高、效率低、成功率低的问题，基于现有的乳铁蛋白序列，利用生物信息学手段完成筛选，并通过实验验证，能够高效快速地筛选出抗菌肽。本发明的抗菌肽来源于乳铁蛋白序列，实现来源良好生物兼容性、绿色、安全的目标。

3、为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

4、本发明提供来源于乳铁蛋白的抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no：1至98任一所示；优选地，其氨基酸序列如seq id no：1至8、31-36、64-77、86-89任一所示；更优选地，其氨基酸序列如seq id no:2、seq id no:31-32、seq id no.36、seq id no:64、seq id no:67-73、seq id no:77、seq id no.86和seq id no.88任一所示。

5、本发明还提供编码所述的抗菌肽的核酸，以及含所述的核酸的表达载体或重组细胞。

6、本发明进一步提供所述的抗菌肽在抗菌或抑菌中的应用。其中，抗菌或抑菌是指大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、红平红球菌、枯草芽孢杆菌、糠秕马拉色菌、新型隐球酵母或白色念珠菌的抗菌或抑菌作用；优选地，抗菌或抑菌是指对恶臭假单胞菌、红平红球菌、枯草芽孢杆菌、糠秕马拉色菌、新型隐球酵母或白色念珠菌的抗菌或抑菌作用。

7、本发明还提供所述的抗菌肽或其编码核酸在制备抗菌产品中的应用。具体地，所述产品是指药品、化妆品、洗护用品、食品、保健品或农药；优选地，所述抗菌是指大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、红平红球菌、枯草芽孢杆菌、糠秕马拉色菌、新型隐球酵母或白色念珠菌的抗菌或抑菌作用；更优选地，抗菌指对恶臭假单胞菌、红平红球菌、枯草芽孢杆菌、糠秕马拉色菌、新型隐球酵母或白色念珠菌的抗菌或抑菌作用。

8、本发明通过创新的采用了重叠肽库设计乳铁蛋白肽文库，实现全序列建立乳铁蛋白肽库，节省了时间和成本，提高了水解产物序列组成的准确度，在生物信息学生物活性肽领域具有独创性。其中，通过创新的采用了amp scanner vr.2服务器预测和筛选具有较高活性乳铁蛋白抗菌肽，实现了一个高通量筛选乳铁蛋白抗菌肽的方法，在节省纯化、鉴定肽序列的时间和成本的前提下，缩小了在生物活性测定中实际测试的化合物的数量，提高了筛选成功的机率。

9、具体地，本发明的提供的肽具有广谱的抗菌作用，尤其是对恶臭假单胞菌、红平红球菌、枯草芽孢杆菌、糠秕马拉色菌、新型隐球酵母和白色念珠菌具有抑菌作用。

10、本发明通过创新性的实现了一种基于生物信息学建立乳铁蛋白肽库的方法。利用重叠肽库的技术，结合食源性乳铁蛋白，可以快速的建立全序列肽库，大大节省了时间和成本，提高了结果的准确度。并基于生物信息学高通量筛选乳铁蛋白抗菌肽的方法。利用ampscanner vr.2服务器，结合乳铁蛋白肽库，可以快速的筛选出较高活性的抗菌肽，大大节省了人力物力消耗，避免筛选过程中的有毒试剂对实验人员的危害，提高了筛选效率和肽库容量带来的限制等问题。由此本发明获得的肽具有广谱的抗菌作用，尤其是对恶臭假单胞菌、红平红球菌、枯草芽孢杆菌、糠秕马拉色菌、新型隐球酵母和白色念珠菌具有显著的抑菌作用，具有较大应用价值。