检测Choanephoracucurbitarum的靶标、LAMP引物组合物及其应用

本发明属于生物技术检测领域，涉及检测choanephora cucurbitarum的靶标、lamp引物组合物及其应用。

背景技术：

1、瓜笄霉(choanephora cucurbitarum)是一种重要的植物病原菌，属于接合菌门真菌，能侵染多种植物，如瓜类、秋葵、薄壳山核桃和油菜等，世界广布，寄主范围广泛，引起植株湿腐、果腐、花腐、芽枯、叶斑等多种症状，在受侵染植物生产中造成较重的经济损失。choanephora cucurbitarum主要以菌丝体随病残体或产生接合孢子留在土壤中越冬，翌年春天侵染植物，发病后病部长出大量孢子，借风雨或昆虫传播。该菌腐生性强，只能从伤口侵入生活力衰弱的花、叶或果实。棚室栽培的植物，在高温高湿，生活力衰弱或低温、高湿条件，日照不足、雨后积水、有伤口的情况易发病。

2、目前，针对choanephora cucurbitarum的检测技术较少。传统的检测方法主要是应用平板分离法，依据choanephora cucurbitarum的形态学进行鉴定。该方法耗时耗力，需要丰富和专业的病原菌鉴定经验，而且很难依据形态学特征将choanephora cucurbitarum与相近种区分开，无法满足田间生产上的需求。普通pcr技术需要精密变温设备和高级复杂的分析仪器，或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高，且反应时间长，不利于基层推广。

3、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是近些年开发的一种新的核酸扩增技术，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原菌的检测研究。lamp技术作为一种恒温核酸扩增技术，其最大的优点在于反应速度快、设备简单，而且结果易于鉴定，尤其适用于基层检验检疫机构和医疗机构。目前国内外尚未见利用lamp技术检测choanephora cucurbitarum的相关报道。

4、靶标基因的选择是lamp检测的重要因素之一，目前lamp检测设计的引物的来源主要是转录间间隔区(its)，但是没有足够多的位点来区分相似种，因此开发出新的检测靶标成为检测的热点。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中choanephora cucurbitarum的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及pcr检测技术需要热循环仪器，无法快速检测choanephora cucurbitarum的问题，而提供了一种快速检测choanephora cucurbitarum的lamp检测引物组合物及其分子检测方法，此方法检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。本发明以rnapolymeraseiilargestsubunit(rpb1)基因为检测的靶标序列，设计了choanephora cucurbitarum的特异性的lamp引物组合物，在此基础上建立了choanephora cucurbitarum的lamp快速检测方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现：

2、特异性检测靶标rpb1在检测choanephora cucurbitarum中的应用，所述特异性检测靶标rpb1的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、检测choanephora cucurbitarum的lamp引物组合物，该引物组合物由以下引物组成:如seq id no.2所示的正向内引物fip，如seq id no.3所示的反向内引物bip，如seq idno.4所示的正向外引物f3，如seq id no.5所示的反向外引物b3，如seq id no.6所示的反向环引物lb。

4、本发明所述的引物组合物在制备choanephora cucurbitarum的lamp检测试剂盒中的应用。

5、一种检测choanephora cucurbitarum的lamp试剂盒，含有本发明所述的引物组合物。

6、所述的检测choanephora cucurbitarum的lamp试剂盒，还包含以下组分：10×thermopolbuffer，mgs04，dntps，甜菜碱，bstdnapolymerase，羟基萘酚蓝。

7、本发明所述的引物组合物或试剂盒在检测choanephora cucurbitarum的应用。

8、一种choanephora cucurbitarum的lamp检测方法，其特征在于提取待检微生物dna，取dna溶液作为反应模板，加入所述lamp试剂盒中的检测溶液进行lamp反应，然后观察扩增产物的颜色变化，若呈天蓝色表示检测结果为阳性，存在choanephora cucurbitarum，若呈紫色表示检测结果为阴性，不存在choanephora cucurbitarum。

9、作为本发明的一种优选，所述的lamp反应体系：2.5μl10×thermopol buffer，8mmol·l-1mgs04，1.2mmol·l-1dntps，内引物fip和bip各1.6μmol·l-1，外引物f3和b3各0.4μmol·l-1，0.8μmol·l-1环引物lb，0.8μmol·l-1甜菜碱，8u·μl-1bstdnapolymerase，180mmol·l-1羟基萘酚蓝，2μl模板dna，灭菌水补至26μl。

10、作为本发明的一种优选，所述lamp反应的程序为：63℃反应扩增60min。

11、本发明的检测choanephora cucurbitarum的方法，以提取的dna为模板，利用所述的lamp引物组合物进行lamp反应；hydroxylnaphthol blue(hnb)属于金属离子指示剂的一种。hnb是mg2+的滴定剂，其颜色随溶液ph变化而改变，因此可以通过监测lamp反应体系中mg2+浓度的变化及溶液ph而起到颜色指示剂的作用。反应前将hnb加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中mg2+与lamp反应的副产物结合产生大量沉淀，溶液中mg2+浓度降低，ph发生变化，从而使hnb的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断choanephora cucurbitarum的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在choanephora cucurbitarum；紫色表示检测结果为阴性，不存在choanephoracucurbitarum。

12、本发明与现有技术相比,其优点和积极效果表现在:

13、本发明发现了新的靶标基因用于choanephora cucurbitarum的lamp检测，基于该基因，尤其是该基因上的特异靶区域，本发明设计了lamp引物组合物用于choanephoracucurbitarum的检测，具有特异性强、准确度高、灵敏度好的优点。

14、(1)实用性好。普通pcr反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散,这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(eb)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而lamp反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过观察溶液颜色的变化，判断是否有目标菌株的存在，提高其在田间的应用价值。

15、(2)恒温扩增。不像pcr法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源lamp反应就可以发生，极大的扩展了lamp使用的范围，lamp之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在lamp反应液中添加了甜菜碱，使双链dna处于解链的动态平衡中，在bstdna聚合酶的作用下实现扩增。

16、(3)准确性高：由于传统choanephora cucurbitarum检测方法只是依据形态特征来进行鉴定，而choanephora cucurbitarum的生长受温度影响形态不稳定，同时受到相近种的影响，很难准确鉴定出来。而本发明根据choanephora cucurbitarum的rpb1基因(genbank登录号：mt500038)的序列，该序列在choanephora cucurbitarum中的基因组进化区和保守区轮流间隔。利用blast软件将choanephora cucurbitarum的基因组序列与其它真菌的基因组序列进行比较，选取了choanephora cucurbitarum特有的一端序列并设计特异性的lamp引物。lamp反应通过4条引物(fip、bip、f3、b3)特异性识别靶序列上的6个独立区域(表1)，其特异性比较高。此外，反向环引物lb能够提高反应速率，和其它四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行choanephora cucurbitarum检测。lamp反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都比较高。

17、(4)灵敏度高：本发明建立的choanephora cucurbitarum的lamp检测方法，灵敏度非常高，可以达到100pgdna，表明该检测方法足以在dna浓度较低情况下准确快速地检测出choanephora cucurbitarum。

18、为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。