一种检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感方法

本发明属于生物传感器领域，特别涉及一种检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感方法。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、卡那霉素是一种广谱氨基糖苷类抗生素。它通过干扰蛋白质合成，来有效抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生物活性。卡那霉素具有良好的抗菌性能，但卡那霉素的过度使用甚至滥用会导致其在动物源性食品中的残留。残留的卡那霉素通过食物链积聚在人体内，严重危害人体健康。为了避免危害，中国和欧盟都规定了动物源性食品中卡那霉素的最大残留限值(200μg/kg和150μg/kg)。因此，灵敏检测动物源性食品中卡那霉素残留，对保障食品安全具有重要意义。

3、迄今已建立多种卡那霉素检测方法，包括液相色谱-质谱法、毛细管电泳和酶联免疫吸附法(elisa)。它们有各自的优点，但也存在所需仪器昂贵、样品制备复杂、抗体昂贵等缺点，这限制了它们的广泛应用。因此，迫切需要建立成本效益高、灵敏的方法来检测食品中的卡那霉素残留，以确保食品安全。

4、核酸适配体是指通过体外指数富集(selex)技术筛选的单链寡核苷酸。它能高亲和力的特异性识别靶分子，核酸适配体现在广泛应用于构建各种靶分子检测的适配体传感器。与抗体相比，适配体具有合成容易、修饰简单、靶分子广泛、稳定性高、成本低的特点。2011年，卡那霉素适配体通过selex技术成功筛选。最近，基于适配体和卡那霉素的特异性生物识别作用，构建了多种用于卡那霉素检测的适配体传感器，包括电化学、比色和荧光适配体传感器。在这些适配体传感器中，荧光适配体传感器因其检测速度快、检测灵敏度高而被不断探索。由于纳米材料的特殊光学性质，基于纳米材料的荧光适配体传感器已经被构建用于卡那霉素检测。然而，氧化石墨烯、金纳米粒子等纳米材料的合成和改性是复杂的。而且纳米材料的非均相界面影响反应速率。由于信号放大技术的有效放大能力，先后构建了基于信号放大技术的均匀荧光适配体传感器用于卡那霉素检测，以提高检测性能。传感器的检测灵敏度得到了有效提高，但存在一些局限性，即大多数信号放大技术需要工具酶和标记的荧光团探针。工具酶的合成费用昂贵，而且工具酶的反应条件苛刻。标记探针的合成和修饰复杂昂贵。此外，标记探针的巨大荧光团影响核酸杂交。因此，建立一种高性价比、灵敏度高的荧光适配体传感器检测卡那霉素残留，以确保食品安全迫在眉睫。

5、2004年首次提出的杂交链式反应，是一种无酶、高效、熵驱动的扩增过程，可以避免上述缺点。近年来，杂交链式反应已被应用于构建具有优异检测性能的适配体传感器，用于检测蛋白质、金属离子、农药和代谢物。但目前尚无基于杂交链式反应构建的检测卡那霉素的荧光适配体传感器。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种无酶、免标记的荧光适配体传感器，用于牛奶样品中卡那霉素的灵敏检测。荧光适配体传感器是以适配体与卡那霉素的特异性生物识别和杂交链式反应为基础的。卡那霉素和适配体的识别过程启动了识别探针的构象转变过程。继而启动了两个组装探针的组装过程，以产生具有许多完整g-四链体结构的长双链dna，用于卡那霉素的扩增、无酶检测。n-甲基卟啉二丙酸ix(nmm)选择性地结合完整的g-四链体结构，发射出强的荧光信号，荧光信号明显高于游离nmm单独存在时的荧光信号。g-四链体/nmm输出方式用于卡那霉素的扩增、免标记检测。荧光适配体传感器在食品安全检测中具有广阔的应用前景。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一个方面，提供了一种检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感器，包括：识别探针、组装探针和荧光染料；

4、所述识别探针由适配体序列、触发序列、触发阻滞序列和适配体阻滞序列组成。

5、本发明的第二个方面，提供了上述的免标记无酶荧光适配体传感器在卡那霉素检测中的应用。

6、本发明的第三个方面，提供了上述的检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感方法，包括：

7、将卡那霉素和识别探针混合，并在37℃的tnak缓冲液中反应30分钟，再加入组装探针，其在37℃下启动杂交链式反应30分钟，形成g-四链体结构；

8、向所述g-四链体结构的体系中加入荧光染料，插入完整的g-四链体结构中，并37℃下反应20分钟，检测荧光信号，即得。

9、本发明的有益效果

10、(1)基于杂交链式反应，本发明构建了一种无酶、免标记的荧光适配体传感器，用于灵敏检测牛奶样品中卡那霉素。卡那霉素和适配体的识别过程启动了两个组装探针的组装过程，然后启动了g-四链体/nmm的信号输出过程。卡那霉素启动的杂交链式反应，实现了卡那霉素的扩增、无酶检测，检出限为0.562nm。g-四链体/nmm的信号输出过程，实现了卡那霉素的免标记检测。与其他抗生素相比，该适配体传感器对卡那霉素呈现出较高的选择性，并且传感器成功检测了牛奶样品中的加标卡那霉素。结果证实，该适配体传感器在食品安全检测中具有广阔的应用前景。此外，通过简单地改变适配体序列，荧光适配体传感器可以扩展到食品中其他抗生素残留的检测，这将有效拓宽适配体传感器的应用范围。

11、(2)本发明制备方法简单、实用性强，易于推广。

技术特征：

1.一种检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感器，其特征在于，包括：识别探针、组装探针和荧光染料；

2.如权利要求1所述的检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感器，其特征在于，所述识别探针的序列为如下序列中的一种：

3.如权利要求1所述的检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感器，其特征在于，所述组装探针包括如下序列：

4.如权利要求1所述的检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感器，其特征在于，所述荧光染料为n-甲基卟啉二丙酸ix。

5.权利要求1-4任一项所述的检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感器在卡那霉素检测中的应用。

6.一种权利要求1-4任一项所述的检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感方法，其特征在于，包括：

7.如权利要求6所述的检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感方法，其特征在于，所述识别探针的用量为25～250nm，或，为200nm。

8.如权利要求6所述的检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感方法，其特征在于，所述组装探针中，包括：100～500nm p1和100～500nm p2，或，组装探针分别为400nmp1和400nm p2。

9.如权利要求6所述的检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感方法，其特征在于，荧光染料的用量为1μm。

10.如权利要求6所述的检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感方法，其特征在于，激发和发射的狭缝宽度为10nm，电压为700v，发射光谱从590nm扫描到640nm。

技术总结
本发明属于生物传感器领域，提供了一种检测卡那霉素含量的免标记无酶荧光适配体传感方法。首先，设计由阻滞适配体序列和触发序列组成的识别探针。卡那霉素特异性地识别适配体，然后启动识别探针的构象转变过程，生成具有活化触发序列的适配体‑卡那霉素复合物。活化的触发序列启动两个部分互补组装探针的交替杂交，生成具有许多完整G‑四链体结构的长双链DNA，用于卡那霉素的扩增、无酶检测。将荧光染料(NMM)插入完整的G‑四链体结构中，发射出强荧光信号，用于卡那霉素的放大、免标记检测。与其他抗生素相比，荧光适配体传感器对卡那霉素具有较高的选择性。此荧光适配体传感器在食品安全检测中具有广阔的应用前景。

技术研发人员：崔万玲,刘金蓉,冯善宇,赵文琪,王艳燕,张佳怡,王瑞,李崇辉,许士才
受保护的技术使用者：德州学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14