表达乙型脑炎病毒E蛋白的重组盖他病毒及其构建方法和疫苗应用

本发明属于病毒蛋白表达，尤其涉及一种表达乙型脑炎病毒e蛋白的重组盖他病毒及其构建方法和疫苗应用。

背景技术：

1、盖他病毒(getah virus,getv)是一种由蚊子传播的人畜共患病毒，属于披膜病毒科，甲病毒属。它于1955年在马来西亚首次从雪背库蚊(culex gelidus)中分离出来，在南太平洋地区广泛传播。自21世纪初以来，getv的范围和地理分布从低纬度热带地区逐渐扩大到北纬60°，从属于蚊科的五个属(culex,anopheles,armigeres,aedes和mansonia)的17种不同种类的蚊子以及欧亚大陆的蠓中分离出来。getv感染的动物从马和猪到感染牛、蓝狐狸和小熊猫等，getv在动物中引起的疾病暴发数量随着受感染动物的类型的增多而逐渐增加。盖他病毒给世界造成的负担被严重低估，给畜牧生产增加的经济成本仍然未知。

2、乙型脑炎病毒(japanese encephalitis virus,jev)是黄病毒科和黄病毒属的成员，是发展中国家最重要的病原体之一，主要在亚洲和太平洋的热带和亚热带地区流行。jev主要是通过蚊虫叮咬传播。猪是jev的储存宿主，人类、马和其他动物是终末宿主。世界卫生组织报告，全球每年发生超过67,900例jev感染病例，其中超过10,000例是致命的。随着全球气温的升高，由于气候变暖，携带jev的蚊子的栖息地范围和活动增加，jev的临床发病率也随之增加，给世界的养猪业带来了巨大的经济损失。e蛋白与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关，e蛋白还具有产生血凝抑制抗体、补体结合抗体、中和抗体的功能，可引起宿主产生保护性的免疫应答,与特异性受体结合可粘附在细胞表膜，因此，e蛋白是jev疫苗的首选蛋白。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种表达乙型脑炎病毒e蛋白的重组盖他病毒及其构建方法和疫苗应用，所得重组毒株稳定性好，外源蛋白表达水平高，具有良好的免疫原性及免疫保护性。

2、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、表达乙型脑炎病毒e蛋白的重组盖他病毒，该病毒具有乙型脑炎病毒e蛋白基因，且e蛋白基因位于盖他病毒基因组的cap和e3基因之间。

4、上述重组盖他病毒的构建方法，将盖他病毒作为亲本毒株，以其感染性克隆pgetv-gv为载体，利用基因工程的方法，在cap和e3间插入截短的乙型脑炎病毒e蛋白，获得重组盖他病毒rgecjev-e；盖他病毒的保藏编号为cctcc no：v 202069；乙型脑炎病毒e蛋白源于猪乙型脑炎病毒疫苗毒株sa14-14-2。

5、上述重组盖他病毒的构建方法，在getv感染性克隆中，使用soe-pcr方法，将部分getv基因组序列，分泌肽usp、截短的jev e蛋白基因，以及flag标签融合，利用swai和srfi两个限制性酶切位点，将融合片段插入cap和e3基因之间，得到重组质粒pgecjev-e，再经转染敏感细胞系进行病毒拯救获得重组盖他病毒rgecjev-e。

6、融合片段具有序列表seq.no.id.14的碱基序列。

7、重组质粒按以下操作进行构建：

8、以getv的全长感染性克隆pgetv-gx为模板，使用扩增引物swaⅰ-f1/cap-r1和flag-t2a-e3-f3/srfⅰ-r3分别扩增出包含有swai和srfi限制性酶切位点的两端产物pcr产物s1与pcr产物s2；以猪乙型脑炎病毒sa14-14-2cdna为模板，使用突变引物usp-jev-e-f2/jev-e-flag-r2扩增出包含有jev e蛋白的截短序列和flag标签序列的pcr产物s3，使用引物usp-f2/jev-e-flag-r2进行第二轮融合pcr扩增，将扩增产物回收后，使用引物cap-usp-f2/jev-e-flag-r2进行第三轮融合pcr扩增，得到的产物为包含分泌肽usp、jev e蛋白的截短序列和flag标签序列的pcr产物s4；以pcr产物s4和pcr产物s2为模板，使用突变引物cap-usp-f2/srfⅰ-r3进行融合pcr扩增，以融合后的pcr产物和pcr产物s1为模板，使用外侧引物swaⅰ-f1/srfⅰ-r3进行最后一次融合扩增；将最后融合的pcr产物s5使用swai和srfi酶切，同时酶切载体getv的全长感染性克隆pgetv-gx；将酶切后含有酶切位点的融合pcr产物片段通过t4 dna连接酶克隆至pgetv-gx中，即得重组质粒pgecjev-e；

9、引物swaⅰ-f1、cap-r1、flag-t2a-e3-f3、srfⅰ-r3、usp-jev-e-f2、jev-e-flag-r2、cap-usp-f2、usp-f2、分别具有序列表seq.no.id.1-8的碱基序列；

10、分泌肽usp、jev e蛋白的截短序列和flag标签序列分别具有序列表seq.no.id.11-13的碱基序列。

11、敏感细胞系为bhk-21细胞、pk-15细胞、marc-145细胞。

12、上述重组盖他病毒在制备疫苗或药物中的应用。

13、上述任一构建方法得到的重组质粒或重组病毒在制备疫苗或药物中的应用。

14、重组二价疫苗，由上述重组盖他病毒或任一构建方法得到的重组质粒或重组病毒制备而得。

15、针对目前缺乏同时预防盖他病毒(getv)和乙型脑炎病毒(jev)的疫苗的问题，发明人构建了一种表达乙型脑炎病毒e蛋白的重组盖他病毒，该病毒具有乙型脑炎病毒e蛋白基因，且e蛋白基因位于盖他病毒基因组的cap和e3基因之间。据此还建立了相应构建方法，将盖他病毒作为亲本毒株，以其感染性克隆pgetv-gv为载体，利用基因工程的方法，在cap和e3间插入截短的乙型脑炎病毒e蛋白，获得重组盖他病毒rgecjev-e；盖他病毒的保藏编号为cctcc no：v 202069；乙型脑炎病毒e蛋白源于猪乙型脑炎病毒疫苗毒株sa14-14-2。本发明将外源基因插入cap与e3蛋白基因之间，相较于其他位置，该位置可以容纳的外源基因具有遗传稳定性，在体外至少高达9次病毒传代，外源基因不会随着病毒传代而发生缺失或者丢失。试验表明，

16、ifa结果显示拯救病毒可以被getv特异性抗体识别，表明病毒拯救成功，本发明所述盖他重组病毒rgecjev-e可以稳定地在细胞上形成cpe，病变时间约18～24hpi，毒价为105tcid50/ml-106tcid50/ml，可以在bhk-21细胞上形成与亲本毒株相似的空斑表型，多步生长曲线表明其与亲本毒株走势基本相符，说明外源片段jev e的插入对病毒本身的增殖无影响，使用flag作为一抗，ifa与western blot分析显示，重组病毒rgecjev-e插入的外源片段能够正确的进行表达。

17、免疫小鼠的实验结果表明，首免后第1周可以检测到血清中的jev e蛋白抗体，但抗体水平较低，加强免疫后抗体水平明显升高并且抗体水在两周内维持在一个较高的水平。二免后，采用蚀斑减少中和实验方法测定中和抗体效价，rgecjev-e免疫组的中和抗体效价为＞1/128，其他对照组和阴性组均＜1/5。

18、对靶动物小鼠进行针对乙型脑炎病毒免疫保护性实验结果表明，重组病毒rgecjev-e具有良好的安全性和免疫原性，免疫小鼠后能够对乙型脑炎病毒的攻击提供良好的保护。攻毒后，对照组小鼠攻毒后第三天天开始出现精神沉郁、立毛、运动障碍、弓背、眼睑肿胀，第6d开始死亡，到攻毒后8d全部死亡；免疫rgecjev-e的小鼠没有出现相应的临床症状，攻毒第14d时，共有1只小鼠死亡。

19、综上，本发明重组盖他病毒rgecjev-e具有特性好、稳定性好、外源蛋白表达量高的特点，表达的蛋白具有较好的免疫原性，重组病毒免疫小鼠后，不仅能激发针对盖他病毒的免疫应答，而且能产生针对jev e蛋白的免疫应答特异性抗体，能够对乙型脑炎病毒的攻击提供免疫保护；且病毒载量结果表示重组病毒致病性极低甚至对几乎丧失致病性，表示重组毒株的安全性较高。

20、因此，本发明重组病毒rgecjev-e在制备预防或治疗盖他病毒和/或乙型脑炎病毒的疫苗或药物中极具潜力，有望开发出一种同时针对盖他病毒和乙型脑炎的重组二价疫苗。