工程化细胞外囊泡的制作方法

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种工程化细胞外囊泡、其制备方法及应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicle,ev)是由细胞分泌的，能够被受体细胞摄取的膜性囊泡小体，直径大约为30-1000nm。ev作为蛋白质、rna、脂质等生物大分子在细胞间转运的载体，是细胞与细胞间通讯的重要媒介。因ev广泛存在于人体的各种体液中，既可以作为液体活检的样本来源，也被认为是一种天然驯化的药物载体。

2、ev可作为药物载体携带和运输“货物”，例如具有治疗效果的多肽和蛋白。为了让ev携带的货物蛋白能够发挥效果，需要确保货物蛋白在ev内的量足够高。然而，在细胞中异源表达的非外泌体货物蛋白并不会被主动分拣到细胞外囊泡中。

3、根据已有的报道，目前有约20种蛋白被报道可用于货物蛋白在ev中的装载(theranostics,2019；9(4):1015-1028)。wo2013084000a2、wo2014168548a2、wo2018015535a1、wo2019040920a1等专利申请也描述了将蛋白装载到ev的方法。

技术实现思路

1、本技术的发明人在研究中意外发现一种多肽能够将与之融合的货物蛋白携带并富集至细胞外囊泡中，命名为内载多肽，在此基础上完成本发明。

2、在第一个方面，本发明提供一种融合蛋白，其包含内载多肽和货物蛋白，所述内载多肽位于所述货物蛋白的n端，所述内载多肽包含一个或更多个豆蔻酰化位点和一个或更多个棕榈酰化位点。豆蔻酰化是真核生物蛋白质的一种修饰形式，通常发生在多肽链n端的甘氨酸残基上。棕榈酰化也是真核生物蛋白质的一种修饰形式，最常见的棕榈酰化形式是s-棕榈酰化和n-棕榈酰化，其中，s-棕榈酰化发生在半胱氨酸残基上，n-棕榈酰化反应发生在氨基末端或赖氨酸的ε氨基上。

3、在一些实施方案中，所述豆蔻酰化位点和所述棕榈酰化位点间隔0至6个氨基酸，例如，间隔0、1、2、3、4、5或6个氨基酸。

4、在另一些实施方案中，所述内载多肽包含式(i)所示的片段，

5、mgx1mcx2n(i)，其中

6、所述式(i)片段长度不小于10个氨基酸，x1和x2各自独立地是任意氨基酸；

7、m为0至6的整数，例如0、1、2、3、4、5或6；

8、n为正整数，例如1至300、2至200、3至100、4至80、5至60或7至30的整数；

9、其中，当m大于1时，所述至少2个x1各自独立地是任意氨基酸；当n大于1时，所述至少2个x2各自独立地是任意氨基酸。

10、在另一些实施方案中，所述内载多肽包含式(ii)所示的片段，

11、mgx1mcx3x4x5x6x7x8x9(ii)，其中

12、m为0至3的整数，例如0、1、2或3；

13、x3选自r、t、l和f，x4选自q、v、l、g、y和p，x5选自s、n、g和c，x6选自s、a、n和p，x7选自e、k、s、n和g，x8选自e、d、t、k和m，和x9选自k、r、e、t和s。

14、在另一些实施方案中，所述内载多肽选自如下序列：

15、

16、

17、在一些优选实施方案中，所述内载多肽选自如下序列：

18、gnaz(1-10)：mgcrqsseek(seq id no:12)，

19、gnai3(1-10)：mgctlsaedk(seq id no:11)，和

20、svip(1-10)：mglcfpcpge(seq id no:9)。

21、在另一些实施方案中，所述内载多肽包含gnaz、gnai1、gnai2、gnai3、gnao、gnas1、gnas2、gnal或svip的n末端起前10个、前15个、前20个、前25个、前32个、前42个或前50个氨基酸。本文所指“n末端起前10个氨基酸”，是指从n端第1个氨基酸至第10个氨基酸；“n末端起前15个氨基酸”，是指从n端第1个氨基酸至第15个氨基酸；以此类推。gnaz、gnai1、gnai2、gnai3、gnao、gnas1、gnas2、gnal均属于g-alpha家族成员。

22、在另一些实施方案中，所述内载多肽包含一个携带正电荷氨基酸残基的多肽片段，所述携带正电荷氨基酸残基的多肽片段形成α螺旋，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的所述正电荷氨基酸残基位于所述α螺旋的同侧。本文所指“α螺旋”(α-helix)具有本领域技术人员理解的含义，是一种常见的蛋白质二级结构，多肽链主链围绕中心轴有规律地螺旋式上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，是一种很稳定的结构。本发明所述内载多肽包含的α螺旋意指一个完整的α螺旋或α螺旋的一部分(α螺旋片段)。本文所述“至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的所述正电荷氨基酸残基位于所述α螺旋的同侧”，是指经过所述α螺旋的中心轴存在一个纵向切面，所述α螺旋肽段的正电荷氨基酸残基至少70％、至少80％、至少90％或至少95％位于切面的一侧。

23、在一些实施方案中，所述内载多肽包含选自如下的序列：

24、gnaz(1-32)：mgcrqsseekeaarrsrridrhlrsesqrqrr(seq id no:1)，

25、gnai1(1-32)：mgctlsaedkaaverskmidrnlredgekaar(seq id no:2)，

26、gnai2(1-32)：mgctvsaedkaaaerskmidknlredgekaar(seq id no:3)，

27、gnai3(1-32)：mgctlsaedkaaverskmidrnlredgekaak(seq id no:4)，

28、gnao(1-32)：mgctlsaeeraalerskaieknlkedgisaak(seq id no:20)，

29、gnas2(1-32)：mgclgnsktedqrneekaqreankkiekqlqk(seq id no:21)，和

30、gnal(1-32)：mgclggnskttedqgvdekerreankkiekql(seq id no:22)。

31、在一些优选实施方案中，所述内载多肽选自如下的序列：

32、gnaz(1-32)：mgcrqsseekeaarrsrridrhlrsesqrqrr(seq id no:1)，

33、gnai1(1-32)：mgctlsaedkaaverskmidrnlredgekaar(seq id no:2)，

34、gnai2(1-32)：mgctvsaedkaaaerskmidknlredgekaar(seq id no:3)，

35、gnai3(1-32)：mgctlsaedkaaverskmidrnlredgekaak(seq id no:4)，和

36、gnas2(1-32)：mgclgnsktedqrneekaqreankkiekqlqk(seq id no:21)。

37、在一些实施方案中，所述货物蛋白是治疗性肽、dna结合蛋白、rna结合蛋白、荧光蛋白、酶或连接治疗化合物的接头。

38、在一些具体的实施方案中，所述治疗性肽是抗体和/或细胞因子，例如所述细胞因子选自人白细胞介素家族成员(例如，il-2,il-7,il-10,il-11,il-12,il-15和il-23)，肿瘤坏死因子家族成员(例如，tnf,lta,ltb,faslg,tnfsf8,tnfsf9,tnfsf10,tnfsf11,tnfsf12,tnfsf13,tnfsf14,tnfsf15,tnfsf18和eda)，干扰素(inf-α,inf-β和inf-γ)，tcell engager(例如，4-1bb,ox40,cd28,cd40,cd40l,cd47,cd27,cd70,cd80,cd86,gitrl,icosl,cd155,cd112,tim-3,btla)，和其他细胞因子(例如，g-csf,epo,tpo,gm-csf,egf,bfgf,fviia,atⅲ,tnk,α-glucosidase,bmp-2,hirudin)。

39、在另一些具体的实施方案中，所述rna结合蛋白选自l7ae、hnrnpa2b1、hnrnpc1、hnrnpg、hnrnpk、hnrnpq、ybx1、hur、ago2、igf2bp1、mex3c、anxa2、alix、ncl、fus和mvp。

40、在另一些具体的实施方案中，所述酶是荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、荧光素酶等。

41、在第二个方面，本发明提供一种工程化细胞外囊泡，其包含第一个方面所述的融合蛋白。

42、在一些实施方案中，所述细胞外囊泡包含两种或更多种融合蛋白，例如所述两种或更多种融合蛋白各自独立地包含不同的货物蛋白。

43、在第三个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含第一个方面所述融合蛋白或第二个方面所述的细胞外囊泡和药学上可接受的载体。

44、在第四个方面，本发明提供一种工程化细胞，其用于生产第二个方面所述的细胞外囊泡。

45、在一些实施方案中，所述细胞包含编码所述融合蛋白的多核苷酸，优选地，所述多核苷酸整合在所述细胞的基因组中。

46、在第五个方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用第一个方面所述的融合蛋白、第二个方面所述的细胞外囊泡、第三个方面所述的药物组合物或第四个方面所述的细胞。本发明还提供第一个方面所述的融合蛋白、第二个方面所述的细胞外囊泡、第三个方面所述的药物组合物或第四个方面所述的细胞在制备用于治疗疾病的药物中的用途。

47、在第六个方面，本发明提供一种细胞外囊泡成像方法，其包括在所述细胞外囊泡中装载第一个方面所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白为荧光蛋白或荧光素酶，优选地，所述荧光蛋白选自gfp(green fluorescent protein)、rfp(red fluorescent protein)、yfp(yellow fluorescent protein)和cp(chromoprotein)；优选地，所述荧光素酶选自萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)、海肾荧光素酶(renilla luciferase)和荧光素酶。

48、在第七个方面，本发明提供一种制备第二个方面所述的细胞外囊泡的方法，其包括

49、1)提供细胞，其包含编码所述融合蛋白的多核苷酸；

50、2)在适合表达所述融合蛋白的条件下培养所述细胞；和

51、3)分离所述细胞外囊泡。