一种人弥漫性恶性腹膜间皮瘤细胞系及其构建方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种人弥漫性恶性腹膜间皮瘤细胞系及其构建方法。

背景技术：

1、弥漫性恶性腹膜间皮瘤(diffuse malignant peritoneal mesothelioma,dmpm)是一种来源于腹腔浆膜层的罕见恶性肿瘤，占所有恶性间皮瘤10～30％。恶性程度高，预后差，中位生存期仅5～12个月。世界卫生组织(world health organization,who)将dmpm组织学类型分三类，上皮型、肉瘤型和双相型，以上皮型多见。腹膜表面肿瘤国际联盟(peritoneal surface oncology group international,psogi)推荐肿瘤细胞减灭术(cytoreductive surgery,crs)联合腹腔热灌注化疗(hyperthermic intraperitonealchemotherapy,hipec)为dmpm标准治疗，中位生存期可延长至3年，但仍有患者不能从crs+hipec中获益。因此，迫切需要探索新治疗方式以改善dmpm患者的预后。

2、然而，目前尚不清楚dmpm的分子生物学特点，而研究dmpm发生发展的病理过程及发病机制，探索诊治新技术，必须有适宜的研究平台，如dmpm细胞系。当前，在国内3个大型的细胞库(中国医学科学院肿瘤细胞库；中科院细胞库；中国典型培养物保藏中心)及美国典型培养物保藏中心(atcc)中，均未发现弥漫性恶性腹膜间皮瘤细胞系。

3、因此，急需一种弥漫性恶性腹膜间皮瘤系，以推进该疾病的研究进程。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种人弥漫性恶性腹膜间皮瘤细胞系(命名为dmpm-01)及其构建方法。

2、本发明的方案是提供一种人弥漫性恶性腹膜间皮瘤细胞系的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

3、(i)dmpm裸小鼠皮下瘤模型的建立：

4、(i-1)将获取的恶性腹膜间皮瘤肿瘤标本进行清洗、剪碎，得到瘤块标本；

5、(i-2)将所述瘤块标本接种至裸小鼠四肢背部皮下部位，待其生长完毕后取出，得到第一代肿瘤组织；

6、(i-3)将所述第一代肿瘤组织剪碎后接种至另取的裸小鼠四肢背部皮下部位，待其生长完毕后取出，得到第二代肿瘤组织，重复操作，直至得到第四代肿瘤组织；需要说明的是，三代之后的肿瘤组织趋于稳定，但考虑时间成本，均选取第四代肿瘤组织进行后续操作；

7、(ii)原代dmpm细胞分离培养、纯化：

8、(ii-1)在无菌条件下，将所述第四代肿瘤组织样本进行清洗及前处理，得到预处理肿瘤样本；

9、(ii-2)将所述预处理肿瘤样本加入分散酶ii进行消化裂解，得到肿瘤细胞悬液；

10、(ii-3)将所述细胞悬液过滤、离心后弃去上清液，再进行重悬，之后进行培养；

11、(ii-4)培养过程中加入分散酶ii，然后将肿瘤细胞依次离心、弃去上清液、重悬，之后继续培养；

12、(iii)dmpm细胞系传代培养：

13、将培养液去除后再依次加入胰酶溶液、dmem培养液，然后将细胞悬液继续传代培养即可。

14、优选地，步骤(i-1)中，将手术中获取的恶性腹膜间皮瘤肿瘤标本用无菌rpmi1640无血清培养液洗净后，用无菌眼科剪，剪成碎块，再次置入rpmi1640无血清培养液中，再次清洗后用无菌眼科剪，剪成尺寸为0.8～1.2mm3的瘤块，得到瘤块标本。

15、优选地，步骤(i-2)中，用注射器针筒抽吸所述瘤块标本后，置入直径为2mm的无菌接种针外管中，用带有肿瘤组织的外管分离裸小鼠皮下结缔组织后，通过推动针芯将肿瘤碎块组织接种于裸小鼠四肢背部皮下部位；每3天测量一次裸小鼠的皮下肿瘤体积，待肿瘤体积长至480～520mm3时，用无菌眼科剪，取出肿瘤组织，得到第一代肿瘤组织。

16、优选地，步骤(i-3)中，将所述第一代肿瘤组织洗净、切块后置入rpmi 1640无血清培养液中，切成尺寸为0.8～1.2mm3的瘤块，用直径为2mm的无菌接种针将肿瘤组织接种于裸小鼠四肢背部皮下部位进行传代，每次接种2只裸小鼠，得到第二代肿瘤组织，重复操作，直至得到第四代肿瘤组织。

17、优选地，步骤(ii-1)中，用75％的酒精擦拭超净工作台台面，再用紫外线照射30min消毒灭菌；在无菌条件下将所述第四代肿瘤组织样本先移至含有青霉素及链霉素的dmem培养液，然后将肿瘤样本取出并转移至15ml的离心管中，加入10ml含100u青链霉素的pbs溶液震荡清洗，完成后更换新的含100u青霉素及链霉素的pbs溶液，重复清洗4～5次，直至样本清洗干净；将清洗后的样本转移至无菌培养皿中，用灭菌器械将样本剪成约1～2mm3的碎块，在培养皿中加入含2％fbs、100u青霉素及链霉素的dmem培养液，用移液枪将培养皿吹洗干净，再将肿瘤样本液转移至15ml离心管中，并加入含2％fbs、100u青霉素及链霉素的dmem培养液至8～10ml，混匀后静置3～5min，待肿瘤组织块沉降于离心管底，吸取上层清洗液并弃去，得到预处理肿瘤样本。

18、优选地，步骤(ii-2)中，将所述预处理肿瘤样本转移至含分散酶ii的离心管中，于37℃培养箱的旋转混匀仪上消化裂解肿瘤样本1～2h进行消化裂解，得到肿瘤细胞悬液。

19、优选地，步骤(ii-3)中，将所述肿瘤细胞悬液用70μm的细胞过滤器过滤至50ml的离心管中，用10ml含2％fbs、100u青霉素及链霉素的dmem培养液冲洗细胞过滤器，以提高肿瘤细胞获得率，过滤所得的肿瘤细胞悬液用515g的转速离心5min后，弃去上清液，用含10％fbs、100u青霉素及链霉素的dmem培养液重悬肿瘤细胞，并转移至培养瓶中培养。

20、优选地，步骤(ii-4)中，培养肿瘤原代细胞3～5d后，向培养瓶加入分散酶ii并将培养瓶置于37℃的培养箱中10min，然后将培养瓶中的肿瘤细胞及培养液转移至15ml的离心管中，离心5min，弃去上清液，用培养基重悬肿瘤细胞，最后转移至新的培养瓶中继续培养。

21、优选地，步骤(iii)中，用75％的酒精擦拭超净工作台台面，再用紫外线照射30min消毒灭菌；然后将培养瓶中的培养液吸除后，加入8～10ml的无菌pbs溶液，以清洗残留的培养基成分；随后加入0.5～1ml的0.25％的胰酶溶液，使培养瓶底部的肿瘤细胞浸入胰酶溶液中，待肿瘤细胞趋于圆形时将胰酶溶液去除，并加入10ml含10％fbs、100u青霉素及链霉素的dmem培养液，用以终止消化，最后另取培养基对肿瘤细胞进行传代培养。

22、基于相同的技术构思，本发明的再一方案是提供一种由上述构建方法得到的人弥漫性恶性腹膜间皮瘤细胞系。

23、本发明的有益效果为：

24、本发明所述的dmpm-01细胞系是自主建立的第一株人弥漫性恶性腹膜间皮瘤细胞系，所述细胞系能够在体外稳定存活并稳定传代至第17代，更重要的是能为进一步研究弥漫性恶性腹膜间皮瘤的分子机制、病理发展过程、药物干预实验等提供了细胞实验平台。