检测肺炎支原体及其大环内酯类药物耐药位点的引物组合

本发明属于生物，具体涉及一种检测肺炎支原体及其大环内酯类药物耐药位点的荧光定量pcr方法。

背景技术：

1、肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，mp)是人类支原体肺炎的病原体，在社区获得性肺炎(community acquired pneumonia，cap)病例中占比10-30％，主要经飞沫传染，会引起急性呼吸道感染伴肺部感染，有时并发支气管肺炎，感染后有头痛、发热、阵发性刺激性咳嗽等症状，除呼吸系统的表现外，可发展为难治性肺炎，伴有肺或肺外并发症，严重的支原体肺炎也可导致死亡，约25％的患者因肺外并发症或严重肺炎住院治疗。

2、肺炎支原体菌株没有细胞壁，对影响细胞壁合成的药物不敏感，对影响细菌蛋白质合成的药物如大环内酯类、四环素类、喹诺酮类和氨基糖苷类药物敏感。其中大环内酯类药物因较其他类别药物副作用低，使用无禁忌症而作为临床治疗8岁以下儿童肺炎支原体感染的首选药物，成人治疗首选喹诺酮类抗生素。近年来随着大环内酯类抗生素的广泛使用甚至滥用，肺炎支原体治疗过程中出现耐药现象越来越引起人们的重视。肺炎支原体对大环内酯类药物产生耐药的主要机制为位点突变，突变导致抗生素药物与核糖体亲和力下降引起耐药，其中以23s rrna结构域v区的2063、2064这2个位点最为常见，2067位点和23srrnaⅱ区2617位点次之。

3、目前，mp耐药的检测技术主要有药物敏感性试验(antimicrobialsusceptibility test，ast)和分子生物学技术两种，ast法由于前期培养实验周期长，分离培养阳性率不高，不适用于临床诊断；分子生物学技术常用的有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)技术操作简单、成本低，但测序需要专业机构完成，结果需等待1-2天。虽然目前已有针对肺炎支原体耐药性检测的检测试剂，但是引物探针的设计存在不合理的现象，导致多数检测试剂无法实现准确、快速、灵敏的检测。公布号cn103820557 a发明的引物探针只能进行敏感株和2063位点突变株检测，公布号cn106191239 a只能进行敏感株和2063、2064位点突变株检测。随着大环内酯类药物的使用，产生了新的耐药突变位点，这些新位点的检测对临床指导用药也积极重要。

技术实现思路

1、针对现有肺炎支原体耐药检测的不足，本发明提供了一种检测肺炎支原体及其大环内酯类药物耐药位点的引物组合，本发明利用lan探针技术，针对肺炎支原体23s rrna设计特异性引物和lan探针，实现了对肺炎支原体及耐药型肺炎支原体的高灵敏度检测。

2、本发明引物组合如下：

3、针对肺炎支原体的特异性引物mp-f：ggtggatccaatacaagtgag和mp-r：ctggaaggacgaccctggtcc；针对肺炎支原体的探针为：ccggcatgagtaacgctt gg；

4、针对肺炎支原体23s rrna 2067位点(a/g)的特异性引物为2067-f：ggctatagactcggtgaaatcc和2067-r：cctgatcaatattaagctacag；探针为agg(lna)ccccgtgaagctttactg；

5、针对肺炎支原体23s rrna2617位点(c/g)的特异性引物为2617-f：cgccgattaaagagatacg和gaagcaacactcttcaatcttc；探针为gagacaggttggtcg(lna)ctatctat。

6、本发明提供的肺炎支原体特异性引物探针可实现对肺炎支原体的检测，此外根据肺炎支原体23srrna结构域v区序列，设计2067位点的特异性引物序列，根据肺炎支原体23srrnaⅱ区设计2617位点的特异性引物序列，可实现对2067(a/g)，2617(c/g)两个耐药位点的检测。

7、针对肺炎支原体的探针，5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1猝灭基团；针对2067(a/g)位点的探针，5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq2猝灭基团；针对2617(c/g)位点的探针，5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2猝灭基团。

8、本发明另一目的是将上述引物组合应用在制备肺炎支原体及其大环内酯类药物耐药位点检测试剂中，所述检测试剂包括上述引物组合、野生型和突变型阳性质粒，还包括用于荧光定量pcr的所需常规试剂。

9、本发明利用上述检测试剂快速检测肺炎支原体及耐药突变的方法如下：

10、1、样本类型为痰液、拭子、肺泡灌洗液；

11、2、样品dna提取，采用天隆核酸提取纯化试剂盒(ex-dna/rna病毒4.0)，天隆核酸自动提取仪进行dna提取；

12、3、以步骤2中dna为模板，采用肺炎支原体靶向的特异性引物和探针，进行单重荧光定量pcr检测；

13、检测阳性结果判读包括如下内容：(1)肺炎支原体的探针序列fam荧光探针通道的ct值>36，报告肺炎支原体阳性。(2)针对肺炎支原体23s rrna 2067位点的探针序列cy5荧光探针通道的ct值＜36，报告肺炎支原体为突变型，存在2067(a/g)耐药突变；若ct值＞36或na，则为野生型。(3)针对肺炎支原体23s rrna 2617位点的探针序列rox荧光探针通道的ct值＜36，报告肺炎支原体为突变型，存在2617(c/g)耐药突变；若ct值＞36或na，则为野生型。(4)扩增曲线呈标准“s”型且无异常波动。

14、本发明相比现有技术具有如下优势：

15、本发明提供的引物和lna探针具有良好的特异性，结合real time pcr检测方法，能够实现对肺炎支原体及其耐药突变的快速、准确、灵敏的检测，实验表明，本发明的引物探针的检测肺炎支原体的最低检测限为30copies/ml，肺炎支原体耐药型的最低检测限为50copies/ml。

技术特征：

1.一种检测肺炎支原体及其大环内酯类药物耐药位点的引物组合，引物组合如下：

2.根据权利要求1所述的引物组合在制备肺炎支原体及其大环内酯类药物耐药位点检测试剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一组检测肺炎支原体及其大环内酯类药物耐药位点的引物组合，所述引物组合包括：肺炎支原体特异性引物以及特异性探针、肺炎支原体23S rRNA 2067位点的特异性引物以及LNA修饰的特异性探针、肺炎支原体23S rRNA位点的特异性引物以及LNA修饰的特异性探针；该引物组合同时兼顾了肺炎支原体检测和2067(A/G)、2617(C/G)耐药位点的检测；利用该引物组合制备的检测试剂具有检测灵敏度高、特异性强、重复性良好，对仪器设备要求不高、操作简便、所需时间短等优点，适用于肺炎支原体及其耐药位点的检测，对临床诊疗具有较大的应用价值。

技术研发人员：冯悦,吴甜,刘阳,刘高文,夏雪山
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13