一种同时检测4种肠杆菌科细菌和8种耐碳青霉烯基因的核酸质谱方法和试剂盒

本发明属于生物，涉及一种用于确定4种感染常见肠杆菌及8种耐碳青霉烯基因的特异性基因位点的检测方法及产品，具体而言是利用多重pcr技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对临床感染常见肠杆菌及耐药基因的特异性基因位点进行检测的方法及相应的试剂盒。

背景技术：

1、产碳青霉烯酶肠杆菌(carbapenemase-producing enterobacterales，cpe)的传播不断增加，已成为重大的全球健康威胁。碳青霉烯类抗生素对超广谱β-内酰胺酶(esbl)和头孢菌素酶具有高度的稳定性，但可被碳青霉烯酶水解、灭活，随着临床治疗药物的广泛应用，产生了耐碳青霉烯类的菌株，这给临床抗感染治疗带来了严峻的挑战。最具临床相关性的碳青霉烯酶属于ambler a类或b类或ambler d类。ambler a类碳青霉烯酶包括世界范围内传播的碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(kpc)型酶，以及较小程度上的ges、sme、imi、nmc-a和fri-1变体；b类分为3个主要组：imp、vim和ndm类型；d类大多属于(i)肠杆菌中oxa-48组(包括越来越多的变体)，以oxa-181和oxa-232为主；(ii)oxa-23、oxa-24/-40、oxa-58、oxa-143样酶，以及(iii)铜绿假单胞菌中oxa-198。除产生碳青霉烯酶外，少数菌株对碳青霉烯类药物耐药的机制是产生超广谱β内酰胺酶和/或ampc酶合并外膜孔蛋白表达下调或缺失，如耐药基因cmy-2、adc-68。在中国2016年至2018年期间，97.4％耐碳青霉烯类肠杆菌产碳青霉烯酶，其中kpc-2占51.6％；ndm占35.7％；oxa-48-like占7.3％。最主要的cpe为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌。快速准确的检出耐药基因至关重要。虽然目前检测方法主要分为表型检测和基因型检测，表型检测包括carba np试验、mcin和ecin等。但临床上多采用纸片表型的酶型检测的方法。

2、目前国际上，实验室鉴定细菌病原微生物通行的金标准依然是血培养法，除此之外，临床上常用的方法是病原体蛋白多肽特征指纹图谱(蛋白质质谱)。

3、病原体蛋白多肽特征指纹图谱：此方法通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对病原体中的蛋白多肽进行检测。该方法特异性较差，当被检样品图谱质量不好时(峰高不足，峰型不好，位置偏移和杂峰干扰)，对数据库比对造成很大困难，阻碍评分过程，影响结果的判定；其次，该种鉴定方法仍然需要增菌培养，分离菌落等流程，鉴定周期与血培养相差无几，只是解决了最后对所分离菌落的通量问题，一旦样本在保存和运送中存贮不当，造成细菌死亡，则无法进行多肽的检测；而且，该方法只能对高纯度的菌落进行有效鉴定，很难实现对混合菌的准确鉴定。

4、纸片酶型检测：受人工操作影响大，假阴性多，且对拥有多个耐药基因的检测困难。

5、测序：一代测序虽然读长较长、准确性高，但是测序成本高、通量低，使得de novo测序、转录组测序等应用难以普及。二代测序优点是相比一代测序大幅降低了成本，保持了较高准确性，并且大幅降低了测序时间，将一个人类基因组从3年降为1周以内。缺点是序列读长方面比第一代测序技术要短很多。三代测序优点是读长较长，可以减少拼接成本，节省内存和计算时间。缺点是单读长的错误率偏高，需重复测序以纠错(增加测序成本)。

6、pcr：常规pcr跑胶的灵敏度不够。无条带不能说明没有产物扩增出来，而且电泳算出来的片段长度没有那么准确的，通过条带的位置判断产物大小是很粗糙的方法，可能和实际相差10个碱基以上。但质谱仪精度可以达到0.1ng或以上，更好判断是产生哪个产物。

7、综上所述，建立高效的无需增菌培养可直接对感染含有4种肠杆菌及相关8种耐碳青霉烯基因进行鉴定的方法，对指导感染性疾病的精准诊断、精准治疗、精准用药具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种同时检测4种肠杆菌科细菌和8种耐碳青霉烯基因的核酸质谱方法。

2、本发明同时检测4种肠杆菌科细菌和8种耐碳青霉烯基因的核酸质谱方法的原理在于：联合多重pcr技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测含有耐碳青霉烯基因的常见肠杆菌。其中：在多重pcr中同时扩增多达12个致病菌毒力因子相关的dna片段；在单碱基延伸过程中，对多重pcr的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在12个毒力因子特异位点处分别延伸一个核苷酸；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质。

3、本发明的目的还在于提供一种同时检测4种肠杆菌科细菌和8种耐碳青霉烯基因的pcr引物系统和试剂盒。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、一种同时检测4种肠杆菌科细菌和8种耐碳青霉烯基因的引物系统，包含pcr扩增引物和延伸引物，其中pcr引物5'端有保护碱基的tag：acgttggatg。所述的引物系统具体包含选自如下组的引物(具体序列信息请参见表1、表2和序列表)。

6、1)肺炎克雷伯菌(k.pneumonia)基因的检测：seq id no：1和2所示的扩增引物，seq id no：3所示的延伸引物；

7、2)鲍曼不动杆菌(a.baumannii)基因的检测：seq id no：4和5所示的扩增引物，seq id no：6所示的延伸引物；

8、3)大肠埃希菌(e.coli)基因的检测：seq id no：7和8所示的扩增引物，seq idno：9所示的延伸引物；

9、4)铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)基因的检测：seq id no：10和11所示的扩增引物，seq id no：12所示的延伸引物；

10、5)耐药基因kpc-2的检测：seq id no：13和14所示的扩增引物，seq id no：15所示的延伸引物；

11、6)耐药基因ndm型的检测：seq id no：16和17所示的扩增引物，seq id no：18所示的延伸引物；

12、7)耐药基因oxa-48型的检测：seq id no：19和20所示的扩增引物，seq id no：21所示的延伸引物；

13、8)耐药基因oxa-23的检测：seq id no：22和23所示的扩增引物，seq id no：24所示的延伸引物；

14、9)耐药基因imp型的检测：seq id no：25和26所示的扩增引物，seq id no：27所示的延伸引物；

15、10)耐药基因vim型的检测：seq id no：28和29所示的扩增引物，seq id no：30所示的延伸引物；

16、11)耐药基因cmy-2的检测：seq id no：31和32所示的扩增引物，seq id no：33所示的延伸引物；

17、12)耐药基因adc-68的检测：seq id no：34和35所示的扩增引物，seq id no：36所示的延伸引物。

18、表1.pcr扩增引物

19、

20、

21、表2.延伸引物

22、

23、

24、一种同时检测4种肠杆菌科细菌和8种耐碳青霉烯基因的试剂盒，包含上述引物系统。

25、进一步地，所述的试剂盒还包含如下试剂中的一种或多种：(1)用于提取细菌基因组dna的试剂；(2)用于pcr的反应试剂；(3)去dntps反应的试剂；(4)延伸反应的试剂。

26、一种同时检测4种肠杆菌科细菌和8种耐碳青霉烯基因的核酸质谱方法，具体步骤包括：

27、(1)多重pcr：使用上述引物系统中的全部扩增引物(表1)，在含有病原菌dna的反应体系中进行扩增。在1个反应体系中，对4种病原菌及8种耐药基因特异位点所在dna区域同时进行扩增，得到含12处基因位点所在dna区域的pcr产物。

28、(2)pcr产物纯化：对步骤(1)得到的pcr产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰。

29、(3)单碱基延伸：使用上述引物系统中的全部延伸引物(表2)对步骤(2)得到的纯化后pcr产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的毒力因子特异位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与毒力因子特异位点处的基因型互补配对。在1个反应体系中，进行上述单碱基延伸。

30、(4)质谱仪检测：将步骤(3)得到的产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测。

31、上述4种病原菌及8种耐药基因特异位点分别是：肺炎克雷伯菌的khe基因位点(5841.8-t)、鲍曼不动杆菌的oxa基因位点(5438.6-t)、大肠埃希菌的udia基因位点(7111.5-t)、铜绿假单胞菌的gyrb基因位点(6487.1-a)、耐药基因kpc-2基因位点(7379.8-g)、耐药基因ndm型的基因位点(6406.2-g)、耐药基因oxa-48基因位点(6365.2-g)、耐药基因oxa-23基因位点(4849.2-a)、耐药基因imp基因位点(7726.1-g)、耐药基因vim型基因位点(7032.5-t)、耐药基因cmy-2的基因位点(6510.1-t)、耐药基因adc-68基因位点(5873.8-g)。

32、所述的同时检测4种肠杆菌科细菌和8种耐碳青霉烯基因的核酸质谱方法为非疾病诊断的目的。

33、本发明优点和效果如下：

34、1.灵敏度高：本发明综合了多重pcr、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过pcr技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用pcr检测多态性基因位点，因此它的检测灵敏度很高。

35、2.特异性强：单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对dna分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低。

36、3.快速：速度快、高通量，可在5-6小时内完成数百个样本的检测。

37、4.本发明可一次性对病原菌(肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌)及包含的耐碳青霉烯基因(kpc-2、ndm型、oxa-48型、oxa-23型、imp型、vim型、cmy-2和adc-68)进行检测，患者可能是单重细菌感染也可多重细菌感染，既可能含有一个耐碳青霉烯基因也可能含有多个耐碳青霉烯基因，本发明可以一次性将其检出，而且不论是菌落还是临床标本都能准确检出，特别是对于临床标本，如痰标本、血标本、脓液、支气管灌洗液、尿标本等，可直接检测，无需传统的培养，节约了大量时间，从而为临床治疗节约时间，为临床早期识别主要革兰阴性菌感染和合理使用抗生素提供证据，避免延误治疗及抗生素不规范使用。