维持免疫球蛋白Fc片段与FcRn结合亲和力的免疫球蛋白Fc缀合物的制作方法

本发明涉及生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物，所述缀合物包括通过非肽基连接体与具有fcrn-结合区域的免疫球蛋白fc片段连接的生理活性多肽，并且能够维持免疫球蛋白fc片段内在结合亲和力；制备该缀合物的方法、维持该缀合物对fcrn的内在结合亲和力的方法；以及包括该缀合物的组合物，所述组合物能够维持免疫球蛋白fc片段对fcrn的内在结合亲和力。

背景技术：

1、已经对包含与蛋白质连接以增加蛋白质血清半衰期的载体——如聚乙二醇聚合物、白蛋白、脂肪酸或抗体fc(恒定区)——的蛋白质缀合物或复合物进行了各种研究。迄今为止已知有关此类蛋白质缀合物或复合物的研究主要目的是增加药物的血清半衰期以缩短给药间隔，从而提高患者方便性。然而，许多常规技术存在问题，如由于例如由治疗性蛋白和载体蛋白之间的非特异性结合引起的空间位阻而使治疗性蛋白的活性降低。此外，在可逆结合至血清白蛋白以增加其血清半衰期的脂肪酸缀合物的情况下，因为由于蛋白质和脂肪酸之间的可逆结合而无法避免肾脏清除——导致蛋白质药物的最大损失，显著提高蛋白质药物的血清半衰期是有限的。

2、而且，已经做出努力以利用免疫球蛋白片段增加包括蛋白质的生物活性物质的半衰期。免疫球蛋白fc的ch2-ch3区域包括延长抗体半衰期的fcrn(保护性受体)-结合位点。fcrn是在血管内皮细胞中表达的mhc i类相关蛋白质，并且与igg和白蛋白结合。典型地，igg和fcrn在弱酸性ph下彼此紧密结合并且在中性ph下彼此解离。因此，当igg通过胞饮作用或内吞作用从血管进入血管内皮细胞并进入溶酶体(ph6.0)时，其受到fcrn保护而不被降解。当igg通过再循环与细胞膜融合时，其在ph7.4下与fcrn解离并且被释放到血管中。因为该过程，包括fcrn-结合位点的igg1、igg2和igg4的体内半衰期平均为3周，比其它蛋白质的体内半衰期长。

3、因此，当免疫球蛋白fc片段与生物活性物质连接时，可以通过fcrn-介导的再循环增加生物活性物质的半衰期。对此，有必要开发出能够在生物活性物质和免疫球蛋白fc片段连接在一起时维持免疫球蛋白fc片段对fcrn结合亲和力而不降低生物活性物质活性的方法。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明人已作出大量努力来开发这样的缀合物，其能够维持免疫球蛋白fc片段自身对fcrn的内在结合亲和力而不降低生理活性多肽的活性，并且能够在中性ph下容易与fcrn解离。结果，本发明人发现，包括通过非肽基连接体与具有fcrn-结合区域的免疫球蛋白fc片段连接的生理活性多肽的缀合物能够维持免疫球蛋白fc片段对fcrn的内在结合亲和力，同时，能够在7.4的中性ph下容易与fcrn解离，从而完成本发明。

3、技术方案

4、本发明的一个目的是提供包含通过非肽基连接体与包括fcrn-结合区域的免疫球蛋白fc片段连接的生理活性多肽的生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物，其中在ph6.0下与fcrn结合的缀合物的量和在ph7.4下与fcrn结合的缀合物的量的结合比率在通过在用于该缀合物的相同条件下测量免疫球蛋白fc片段与fcrn结合的量而测定的比率的±6％范围内。

5、本发明的另一个目的是提供包含通过非肽基连接体与包括fcrn-结合区域的免疫球蛋白fc片段连接的生理活性多肽的生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物，其中通过将在ph6.0下与fcrn结合的缀合物的量和在ph7.4下与fcrn结合的缀合物的量代入下列等式1而测定的结合比率在通过在用于该缀合物的相同条件下测量与fcrn结合的免疫球蛋白fc片段的量而测定的结合比率的±6％范围内：

6、等式1

7、结合比率(％)＝(在ph7.4下结合的量/在ph6.0下结合的量)×100。

8、本发明的又一个目的是提供用于制备维持免疫球蛋白fc片段对fcrn的内在结合亲和力的生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物的方法，所述方法包括：(a)通过非肽基连接体将生理活性多肽与具有fcrn-结合区域的免疫球蛋白fc片段连接，以制备生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物的混合物；和(b)从该混合物中分离出生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物，所述缀合物，如通过将在ph6.0下与fcrn结合的量和在ph7.4下与fcrn结合的量代入等式1所测定的，显示出在免疫球蛋白fc片段结合比率的±6％范围内的结合比率。

9、本发明的又一个目的是提供维持生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物对fcrn内在结合亲和力的方法，所述方法包括通过非肽基连接体将生理活性多肽与包含fcrn-结合区域的免疫球蛋白fc片段连接。

10、本发明的又一个目的是提供包含生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物的组合物，其维持免疫球蛋白fc片段对fcrn的内在结合亲和力。

11、有利效果

12、如上所述，本发明的缀合物维持免疫球蛋白fc片段对fcrn的内在结合亲和力，同时，在中性ph(如ph 7.4)下容易与fcrn解离。因此，其能够有利地用于增加生理活性多肽的血清半衰期。

技术特征：

1.生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物，其包括通过非肽基连接体与包含fcrn-结合区域的免疫球蛋白fc片段连接的生理活性多肽，其中在ph6.0下与fcrn结合的缀合物的量和在ph7.4下与fcrn结合的缀合物的量的结合比率在通过在用于所述缀合物的相同条件下测量与fcrn结合的所述免疫球蛋白fc片段的量而测定的比率的±6％范围内。

2.权利要求1所述的缀合物，其中所述生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物的结合比率，如使用下列等式所测定的，在所述免疫球蛋白fc片段的结合比率的±6％范围内：

3.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述缀合物是通过在ph4.0-9.0下使具有与其连接的所述非肽基连接体的所述生理活性多肽与所述免疫球蛋白fc片段反应，从而通过所述非肽基连接体将所述生理活性多肽与所述免疫球蛋白fc片段的除fcrn-结合区外的部分连接而获得。

4.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述非肽基连接体选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合。

5.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述非肽基连接体是由下列式1表示的聚乙二醇聚合物：

6.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述非肽基连接体具有选自醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物的反应性基团，。

7.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述生理活性多肽选自胰高血糖素样肽-1(glp-1)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、人生长激素(hgh)、红细胞生成素(epo)、胰高血糖素、泌酸调节肽、胰岛素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、g蛋白偶联受体、白细胞介素、白细胞介素受体、酶、白细胞介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、b细胞因子、t细胞因子、蛋白a、变态反应抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤阻抑剂、转移生长因子、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、脱脂载脂蛋白-e、高度糖基化红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、凝血调节蛋白、血液因子vii、viia、viii、ix和xiii、纤溶酶原激活因子、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、蛭素、蛋白质c、c-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、制管张素、血管紧张素、骨生长因子、骨刺激蛋白、降钙素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子通道抑制剂、促滤泡激素、黄体生成素、黄体生成素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、促胰液素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、缩胆囊素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自毒素、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、以及抗体片段。

8.权利要求1或2所述的缀合物，其中包含所述fcrn-结合区的所述免疫球蛋白fc片段包括ch2结构域、ch3结构域或二者。

9.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述免疫球蛋白fc片段是非糖基化的形式。

10.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述免疫球蛋白fc片段进一步包括铰链区。

11.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述免疫球蛋白fc片段选自igg、iga、igd、ige、igm、其组合、和其杂合。

12.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述免疫球蛋白fc片段是igg4 fc片段。

13.制备维持免疫球蛋白fc片段对fcrn的内在结合亲和力的生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物的方法，所述方法包括：

14.权利要求13所述的方法，其中所述非肽基连接体是由下列式1表示的聚乙二醇聚合物：

15.权利要求13所述的方法，其中在步骤(b)中分离的所述缀合物具有非肽基连接体与所述免疫球蛋白fc片段的n-末端结合的结构。

16.维持生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物对fcrn的内在结合亲和力的方法，所述方法包括通过非肽基连接体将生理活性多肽与包含fcrn-结合区域的免疫球蛋白fc片段连接。

17.权利要求16所述的方法，其中在体内实施对内在结合亲和力的维持。

18.组合物，其包括权利要求1所述的生理活性多肽-免疫球蛋白fc片段缀合物，所述组合物维持所述免疫球蛋白fc片段对fcrn的内在结合亲和力。

技术总结
本发明涉及维持免疫球蛋白Fc片段与FcRn结合亲和力的免疫球蛋白Fc缀合物。本发明涉及生理活性多肽‑免疫球蛋白Fc片段缀合物，其包含通过非肽基连接体与具有FcRn‑结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接的生理活性多肽并且维持免疫球蛋白Fc片段的内在结合亲和力；制备该缀合物的方法；维持该缀合物对FcRn内在结合亲和力的方法；以及包含该缀合物的组合物，其维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力。

技术研发人员：黄祥渊,李钟守,洪性熙,崔仁荣,郑圣烨,权世昌
受保护的技术使用者：韩美药品株式会社
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12