同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒I型的引物组、试剂盒及应用

本发明属于病毒检测，具体涉及同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒i型的引物组、试剂盒及应用。

背景技术：

1、猫杯状病毒感染(fcv)、猫病毒性鼻气管炎(fhv-ⅰ)和猫泛白细胞减少症(fpv)是临床上猫科动物常见的三大重要传染病，是外国兽医手册规定的、必要进行疫苗免疫预防的疾病，严重威胁宠物行业的健康稳定发展。疾病的早期、高效检测，对于疾病防控至关重要，因而改进现有检测方法、降低检出阈值、提升检测方法的敏感性，对于宠物疾病的预防防控至关重要。

2、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)是一种体外快速扩增dna的技术，因其设备操作简单，不需要专业技术人员，3-5小时即可获得可靠结果，这些优势使得pcr技术已经成为病原检测最常用的技术。在宠物疾病诊断领域也不例外，如刘宝山等人在2010年建立了猫疱疹病毒i型pcr检测方法(刘宝山,林颖,尹荣焕,等.猫疱疹病毒1型pcr检测方法的建立[j].畜牧与兽医,2010,42(1):74-76.)，王吉等人在2015年建立了猫泛白细胞减少症病毒的pcr检测方法(王吉,付瑞,卫礼,等.猫细小病毒pcr检测方法的建立及初步应用[j].实验动物科学,2015,32(1):1-6.)。

3、然而普通pcr是一个复杂的生物化学反应体系，自身存在一定的缺陷，容易出现假阳性结果，造成误判；另外pcr技术的检出阈值相对较高，不利于病毒感染早期鉴别诊断。将纳米金粒子与pcr结合，即可完美地解决普通pcr非特异性扩增的问题，并且在提升扩增敏感性方面也可取得显著的进步。例如赛力克等(赛力克·巴合达吾列提,刘存,刘砚涵,等.猫杯状病毒纳米pcr检测方法的建立[j].中国兽医科学,2021,51(6):684-688.)和叶京飞等(叶京飞,孙飞雁,魏宇,等.猫泛白细胞减少症病毒纳米pcr检测方法的建立与初步应用[j].中国兽医科学,2022,52(8):946-951.)就分别建立了猫杯状病毒和猫细小病毒的单重纳米pcr检测方法，两种方法的敏感性都较普通pcr提升了10倍-100倍不等。

4、但以上方法均为单重pcr技术，仅能对单一病毒感染做出快速准确诊断，而无法对混合感染的情况做出准确判断；多重pcr能实现一个pcr反应检测多种病原菌的目的，完美解决了以上问题，对于猫呼吸道病原和重要肠道病原感染的防控、病原学监测、鉴别诊断等具有重要意义。

5、因此，亟需建立一种敏感性更高的，可同时检测猫杯状病毒、猫病毒性鼻气管炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒的多重纳米pcr技术，这对于宠物疾病的早期诊断具有有非常重要的意义。

技术实现思路

1、为了同时检测猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus，fpv)、猫杯状病毒(feline calicivirus，fcv)和猫疱疹病毒i型(feline hervesvirus-ⅰ，fhv-ⅰ)，并提高检测的特异性和灵敏度，本发明提供了一种用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒i型的多重pcr引物组，所述引物组由三对引物组成：用于猫泛白细胞减少症病毒检测的上、下游引物核苷酸序列如seq id no.1和seq1 no.2所示；用于猫杯状病毒检测的上、下游引物核苷酸序列如seq id no.3和seq1 no.4所示；用于猫疱疹病毒i型检测的上、下游引物核苷酸序列如seq id no.5和seq1 no.6所示。

2、本发明还提供了上述多重pcr引物组在制备用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒i型的多重pcr试剂盒中的应用。

3、本发明还提供了上述多重pcr引物组在制备用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒i型的试剂中的应用。

4、本发明还提供了一种用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒i型的多重pcr试剂盒，所述试剂盒包含上述的多重pcr引物组。

5、进一步地限定，所述多重pcr试剂盒还包括2×rapid taq master mix。

6、优选地，所述多重pcr试剂盒还包括直径为20nm-100nm的纳米金颗粒。

7、更优选地，所述纳米金颗粒的直径为60nm。

8、本发明还提供了上述的多重pcr引物组或上述的多重pcr试剂盒在非疾病诊断和治疗目的的同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒i型中的应用。

9、进一步地限定，所述多重pcr的反应体系为2×rapid taq master mix 12.5μl，浓度为10μm的上游和下游引物各0.5μl，样品核酸或标准质粒1μl，ddh2o补足至25μl，或2×rapid taq master mix 12.5μl，浓度为10μm的上游和下游引物各0.5μl，样品核酸或标准质粒1μl，纳米金颗粒2μl，ddh2o补足至25μl。

10、进一步地限定，所述多重pcr的反应程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，53-55℃退火15s，72℃延伸15s，循环35次，72℃延伸5min。

11、优选地，当多重pcr反应体系为2×rapid taq master mix 12.5μl，浓度为10μm的上游和下游引物各0.5μl，样品核酸或标准质粒1μl，ddh2o补足至25μl时，反应程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸15s，循环35次，72℃延伸5min；当多重pcr反应体系为2×rapid taq master mix 12.5μl，浓度为10μm的上游和下游引物各0.5μl，样品核酸或标准质粒1μl，纳米金颗粒2μl，ddh2o补足至25μl时，反应程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸15s，循环35次，72℃延伸5min。

12、本发明的有益效果：

13、本发明通过设计分别针对fpv、fcv和fhv-ⅰ的特异性引物，获得了能够同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒i型的普通三重pcr(normal-multiplexpcr)检测方法；在此基础上向反应体系中添加纳米金颗粒，通过摸索pcr反应退火温度、添加纳米颗粒的粒径以及添加量等参数，获得了能够同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒i型的三重纳米pcr检测方法。

14、本发明将纳米技术与pcr技术相结合，形成纳米流体，pcr反应能够快速到达目标温度，缩短在非目标温度停留的时间，使整个反应体系在最短时间内达到平衡温度，提高了扩增效率，并具有高度的敏感性(提升100倍)，可用于感染早期和隐性感染期病毒含量较少的临床样本检测。与常规pcr方法比较，该方法省时省力，能够迅速、准确、特异地检测出病原。本发明通过对三重纳米pcr检测方法的特异性及敏感性考察，发现三重纳米pcr完美地解决了普通pcr非特异性扩增问题，极大地提升了宠物猫病原检测的效率，具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间的优点，可为临床控制fcv、fhv-ⅰ和fpv感染提供有力的技术手段。