一种调控百合抗逆性的LoWRKY22基因及其应用

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种调控百合抗逆性的lowrky22基因及其应用。

背景技术：

1、wrky家族是植物中特有且最大的转录因子家族之一，其蛋白质最显著的特征是n端有约60个氨基酸残基，而其中的氨基酸序列wrkygqk是绝对保守的，c端包含一个锌指结构c-c-h-h或c-c-h-c。wrky家族蛋白功能复杂，家族成员广泛参与植物生长发育，涵盖植物生物胁迫、非生物胁迫和植物抗病等方面。不少研究已经证实wrky转录因子在植物抗逆应答分子网络中起着重要的作用，开展wrky转录因子参与植物的衰老研究，将有助于更深入揭示植物衰老调控网络，也有助于培育更多抗衰的新品种。

2、‘西伯利亚’(lilium spp.‘siberia’)是百合鲜切花市场主要的品种之一。在农业生产中，夏季高温会引起植株提前衰老，而百合植株上的叶片作为发育进程中产生能量的主要器官，过早的衰老会降低植物的碳同化和氮吸收能力，影响百合生殖器官的发育，降低切花品质。虽然目前有百合wrky转录因子基因被报道，然而他们的抗病及抗逆机制仍不清晰。因此，本发明将从百合‘西伯利亚’中克隆抗逆相关wrky转录因子基因，以期阐明其功能，解析衰老调控相关机制，为百合基因工程育种提供新的靶基因。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种调控百合抗逆性的lowrky22基因，为百合基因工程育种提供新的靶基因。

2、本发明还要解决的技术问题是，提供上述lowrky22基因在植物衰老调控中的应用。

3、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

4、一种调控百合抗逆性的lowrky22基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、上述调控百合抗逆性的lowrky22基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

6、其中，所述的lowrky22基因，其n端含有典型的氨基酸序列wrkygqk，c端包含一个保守锌指结构c2h2。

7、其中，所述的lowrky22基因，在物种拟南芥中，进化树分析结果表明lowrky22和atwrky27、atwrky29和atwrky22聚类，tair(https://www.arabidopsis.org)中显示其与atwrky22亲缘关系最近，其次为atwrky29和atwrky27。

8、其中，所述的lowrky22基因，在百合叶片中表达量最高。

9、含有上述调控百合抗逆性的lowrky22基因的重组载体也在本发明所保护的范围之内。

10、其中，所述的载体为pcambia1300或bd。

11、其中，所述的pcambia1300载体用于lowrky22基因的表达蛋白的亚细胞定位或lowrky22基因的过表达，其构建的重组载体为pcambia1300-lowrky22。

12、具体的，通过将pcambia1300-lowrky22重组载体转入农杆菌gv3101中，涂布于含有kan和rif的lb固体培养基，30℃恒温箱培养2d，挑取单克隆菌落菌检，选择阳性菌落于kan和rif的lb液体培养基于30℃摇床中过夜培养。将培养14-16h的pcambia1300-lowrky22和pcambia1300农杆菌进行后续烟草侵染试验，结果显示lowrky22翻译蛋白表达定位于细胞核。

13、具体的，将重组载体pcambia1300-lowrky22转入gv3101农杆菌感受态细胞中，28℃摇4h，涂于含kan和rif的lb固体培养基上，28℃倒置培养2-3d。挑选阳性单克隆菌落过夜培养至od600达到1.5-2.0之间，5,000rpm离心5min，5％的蔗糖溶液悬浮菌体至od600达到0.8左右。采用花粉通道法侵染野生型拟南芥，当播种筛选至t3代观察表型。提取侵染后的拟南芥叶片rna进行阳性鉴定，结果显示，阳性拟南芥株系oe4和oe5有扩增条带，野生型无扩增条带。

14、其中，所述的bd载体用于lowrky22基因的转录激活活性分析，其构建的重组载体为bd-lowrky22。

15、具体的，将阳性对照gal4，空载bd载体和bd-lowrky22重组载体分别转入ah109酵母感受态细胞中。再将转化菌落分别涂布于sd/trp固体培养基，30℃恒温箱倒置培养2-3d。挑取单克隆菌落置于100μl灭菌水中，吸5μl菌液分别点于固体培养基sd/-trp，sd/-trp-his，sd/-trp-his+5mm 3at和sd/-trp-his+15mm 3at上，30℃培养2-3d，观察拍照。取一张无菌滤纸平铺在上述sd/-trp板上，轻按滤纸至菌落粘上。夹起滤纸，液氮速冻1min，取出滤纸于室温解冻，重复上述冻融3-5次。将酵母面朝上，吸取1ml z buffer/x-gal溶液均匀滴在滤纸上，30℃暗培养，观察β-半乳糖甘酶显色变化。结果显示，lowrky22在缺陷培养基或抑制培养基上均能正常生长，并且β-半乳糖甘酶显色，lowrky22有转录激活活性。

16、含有上述调控百合抗逆性的lowrky22基因的重组菌也在本发明所保护的范围之内。

17、上述调控百合抗逆性的lowrky22基因或调控百合抗逆性的lowrky22基因的表达蛋白或调控百合抗逆性的lowrky22基因的重组载体或调控百合抗逆性的lowrky22基因的重组菌在植物衰老调控中的应用也在本发明所保护的范围之内。

18、其中，所述的植物为拟南芥或百合。

19、具体的，被侵染后的t3代拟南芥植株表型，相对于野生植株，lowrky22过表达转基因植株表现出叶片提前衰老，植株变矮的表型。

20、具体的，将野生型及t3代拟南芥种子播于同一ms培养基，培养20d，分别提取小苗总rna，反转录后进行半定量实验。半定量结果(图8)显示，相对于对照株系，16个与叶片衰老相关的基因中有7个表达量在lowrky22转基因拟南芥中升高。这表明过表达lowrky22会引起衰老相关基因的表达量升高从而引起拟南芥植株衰老。

21、有益效果：

22、本发明首次克隆百合‘西伯利亚’lowrky22基因序列及其编码蛋白序列。lowrky22定位于细胞核，具有转录激活活性。通过在拟南芥中过表达lowrky22，发现该蛋白会引起植物提前衰老和植株变矮。本研究不仅丰富了植物衰老调控基因库，还为百合衰老调控基因育种提供了一个关键基因。

技术特征：

1.一种调控百合抗逆性的lowrky22基因，其特征在于，所述的lowrky22基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.权利要求1所述调控百合抗逆性的lowrky22基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seqid no.2所示。

3.含有权利要求1所述调控百合抗逆性的lowrky22基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述的载体为pcambia1300或bd。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的pcambia1300载体用于lowrky22基因的表达蛋白的亚细胞定位或lowrky22基因的过表达，其构建的重组载体为pcambia1300-lowrky22。

6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的bd载体用于lowrky22基因的转录激活活性分析，其构建的重组载体为bd-lowrky22。

7.含有权利要求1所述调控百合抗逆性的lowrky22基因的重组菌。

8.权利要求1所述的调控百合抗逆性的lowrky22基因或权利要求2所述的调控百合抗逆性的lowrky22基因的表达蛋白或权利要求3所述的调控百合抗逆性的lowrky22基因的重组载体或权利要求7所述的调控百合抗逆性的lowrky22基因的重组菌在植物衰老调控中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥或百合。

技术总结
本发明公开了一种调控百合抗逆性的LoWRKY22基因及其应用，属于植物分子生物学领域。本发明首先克隆百合基因LoWRKY22，该基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明利用生化试验揭示LoWRKY22定位于细胞核且具有转录激活活性。通过LoWRKY22构建过表达载体转化野生型拟南芥，过表达LoWRKY22基因会降低拟南芥植株高度，促进拟南芥叶片衰老。本发明为百合基因工程改良育种奠定理论基础，为培育百合抗衰老新品种或其它矮化新材料提供重要应用支撑。

技术研发人员：何岭,滕年军,王春彦,闫娜,吴泽
受保护的技术使用者：金陵科技学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12