本发明涉及生物合成领域，具体涉及一种紫丁香苷生物合成工程菌和应用。
背景技术：
1、紫丁香苷(syringin)，又名刺五加苷b(eleutheroside b)，常温下为白色粉末状，溶于热水和乙醇，微溶于冷水，基本不溶于醚，是刺五加(acanthopanax senticosus)中主要的一种具有生物活性的苯丙醇苷类化合物，是中国传统中药刺五加、救必应、槲寄生、暴马丁香皮的主要活性成分，具有降脂降血糖、缓解心肌肥大、保肝护肝解肝毒、抗骨质疏松的作用。动物实验表明，紫丁香苷对肝外科手术中由于组织缺血缺氧而后复氧引起的线粒体损伤具有保护作用，能够抑制肝细胞的凋亡、激活肝组织肿瘤坏死因子的产生，还具有清除自由基、保护神经细胞损伤、抗抑郁以及预防和治疗冠心病、心绞痛、中风等作用，另外在治疗肿瘤联合用药以及急诊快速止血贴剂也均有应用。许多研究表明，紫丁香苷被用来制成各种口服制剂和注射制剂，安全无毒，药理作用强，药效好，有着良好的药用前景。
2、目前，紫丁香苷以植物提取法为主，主要有机溶剂高温提取法、大孔树脂提取法、超声提取法或者多种现有提取手段的结合。例如，cn101307079a公开了一种从铁冬青中提取分离紫丁香苷的方法，并以苯和丙酮作为溶剂提纯分离得到紫丁香苷；cn106188173a公开了一种利用大孔树脂从救必应药材中分离制备紫丁香苷的方法；cn113234110a一种基于pre-hplc从党参中制备党参炔苷、苍术内酯iii和紫丁香苷的方法。
3、现有的从植物中提取紫丁香苷过程中均使用了大量的有机试剂进行萃取纯化，并且部分过程伴随着高温以及废水废气废液的产生，对环境不友好，后续分离纯化难度增加，也不利于大规模制备。近些年随着越来越多的微生物细胞工厂被用于生产多种精细化学品，构建利用可再生资源生产紫丁香苷的微生物细胞工厂便成为了解决上述问题的可行方案。虽然紫丁香苷是刺五加中合成的一种天然物质，但是其天然合成路径尚未完全解析。因此开发一种紫丁香苷的生物合成方法具有非常重要的意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的一个目的是提供一种紫丁香苷生物合成工程菌和应用，该生物合成工程菌主要是向宿主菌中表达紫丁香苷生物合成所需关键酶，该关键酶筛选自大量生物或微生物体内能够合成紫丁香苷的酶，且通过体外依然具有催化效率的酶来实现紫丁香苷的异源高效合成。所述紫丁香苷生物合成工程菌联合对香豆醇发酵培养可以高效率合成紫丁香苷。
2、本发明的另一个目的是提供一种能够实现以葡萄糖、甘油等简单碳源为源头，高效率生物合成的紫丁香苷生物合成工程菌和应用，利用该工程菌能够使得紫丁香苷的产率达到645.26mg/l。
3、因此，为了达到上述目的，本发明提供的以下技术方案：
4、一种紫丁香苷生物合成工程菌，包括宿主菌和在宿主菌中共表达的紫丁香苷生物合成所需的关键酶，该关键酶包括4-羟基苯乙酸-3-羟化酶(4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，hpabc)、咖啡酸甲基转移酶(caffeic acid o-methyltransferase，comt)和糖基转移酶(udp-glycosyltransferase 72e2，ugt72e2)。
5、其中，在本发明中，所述宿主菌为原始或改造过的细菌或真菌；例如原始或改造的大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(pichia pastoris)等。
6、本发明中，咖啡酸甲氧基转移酶英文缩写为comt，4-羟基苯乙酸-3-羟化酶英文缩写hpabc，糖基转移酶缩写为ugt72e2。
7、在本发明中，所述关键酶为来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的酶。
8、所述hpabc优选地来源于克雷伯杆菌k.pneumonia、西班牙糖丝菌saccharothrixespanaensis、新月链霉菌streptomyces lunaelactis、法诺卡菌nocardia farcinica、红球菌rhodococcus ruber。
9、所述comt优选地来源于拟南芥a.thaliana、小麦triticum aestivum、大麦hordeum vulgare、高羊茅festuca arundinacea、黑麦草lolium perenne。
10、所述ugt72e2优选地来源于拟南芥a.thaliana、玉米zea mays、烟草nicotianatabacum、黄花石斛dendrobium catenatum、紫花苜蓿medicago sativa l.。
11、一种紫丁香苷的生物合成方法，包括：将上述紫丁香苷生物合成工程菌在含有对香豆醇的发酵培养基中进行发酵培养得到紫丁香苷的步骤。其中，所述发酵培养基中的对香豆醇的添加量为0.5～1.5g/l。所述发酵培养基中的碳源为单糖、二糖或其任意组合。优选地，所述发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖中的一种或任意组合。优选地，所述发酵培养基为m9培养基。
12、一种紫丁香苷生物合成工程菌，包括对香豆醇生物合成工程菌和在该对香豆醇生物合成工程菌中共表达的紫丁香苷生物合成所需的关键酶，该关键酶包括hpabc、comt和ugt72e2。
13、所述对香豆醇生物合成工程菌包括宿主菌和在该宿主菌中共表达的酪氨酸氨基裂解酶(tyrosine ammonia lyase，tal)、4-香豆酸辅酶a连接酶(4-coumaryl coa ligase，4cl1)、肉桂酰辅酶a还原酶(cinnamoyl-coa reductase，ccr)，乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，adh6)。
14、其中，所述宿主菌中还共表达3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(3-deoxy-d-arabino-heptolosonate-7-phosphate synthetase，arogfbr)以及预苯酸脱氢酶(prephenate dehydrogenase，tyrafbr)，如此主要是为了提高由莽草酸途径合成酪氨酸的产量，从而实现增强上游途径的方式提高对香豆醇生物合成工程菌合成对香豆醇的产量，进而实现提高紫丁香苷生物合成工程菌生物合成紫丁香苷的产量。
15、所述宿主菌中敲除编码丙酮酸激酶i pykf、丙酮酸激酶ii pyka、预苯酸脱水酶phea和酪氨酸转录阻遏因子tyrr的基因；如此主要实现了通过抑制竞争途径的方式提高酪氨酸的产量，从而提高对香豆醇生物合成工程菌合成对香豆醇的产量，进而实现提高紫丁香苷生物合成工程菌生物合成紫丁香苷的产量。
16、本发明中，酪氨酸氨基裂解酶英文缩写tal，4-香豆酸辅酶a连接酶英文缩写为4cl1、肉桂酰辅酶a还原酶英文缩写为ccr、乙醇脱氢酶英文缩写为adh6、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶英文缩写为arogfbr、预苯酸脱氢酶英文缩写为tyrafbr。
17、所述arogfbr、tyrafbr、tal、4cl1、ccr及adh6分别为来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的酶。
18、所述tal优选地来源于类球红细菌rhodobacter sphaeroides、粘红酵母r.glutinis、白色链霉菌streptomyces albus、荚膜红杆菌rhodobacter capsulatus、棘孢小单孢菌micromonospora echinofusca。
19、所述4cl1优选地来源于拟南芥a.thaliana、水稻oryza sativa、烟草nicotianatabacum、毛白杨populus trichocarpa、矮牵牛花petunia hybrida。
20、所述ccr优选地来源于拟南芥a.thaliana、银合欢leucaena leucocephala、云杉picea abies、双色高粱sorghum bicolor、毛白杨populus trichocarpa。
21、所述adh6优选地来源于酿酒酵母saccharomyces cerevisiae、红球菌rhodococcus ruber、铜绿假单胞菌菌pseudomonas aeruginosa、运动发酵单胞菌zymomonas mobilis、醋酸杆菌acetobacter aceti。
22、一种紫丁香苷的生物合成方法，包括：将上述紫丁香苷生物合成工程菌在发酵培养基中进行发酵培养得到紫丁香苷的步骤。其中，所述发酵培养基中的碳源为单糖、二糖或其任意组合。优选地，所述发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖中的一种或任意组合。优选地，所述发酵培养基为m9培养基。
23、请参阅图1，利用本发明提供的上述紫丁香苷生物合成工程菌能够合成紫丁香苷的主要原因是：所述葡萄糖、甘油等简单碳源在工程菌的新陈代谢作用下经过莽草酸途径在酶arogfbr、tyrafbr的作用下转化为酪氨酸，酪氨酸在酶tal的催化下转化为对香豆酸，对香豆酸依次在酶4cl1、ccr、adh6的催化下转化为对香豆醇，对香豆醇在酶hpabc和comt的催化下转化为芥子醇，芥子醇在酶ugt72e2的作用下生成紫丁香苷。由此可见，本发明提供的紫丁香苷生物合成工程菌在发酵培养的过程中，能够以简单碳源为源头，实现简单从头高效生物合成紫丁香苷；也可以通过添加香豆醇高效合成紫丁香苷。
24、因此，本发明通过筛选出在体外具有活性的关键酶，获得本发明提供的上述紫丁香苷生物合成工程菌；以合成紫丁香苷的关键酶为基础，设计出如图1所示的紫丁香苷的生物合成途径，并且利用分子生物学以及代谢调控来优化合成路径，从而实现采用生物方法高效合成紫丁香苷。利用本发明提供的紫丁香苷生物合成工程菌生产紫丁香苷具有方法简单、成本低廉、转化率高等优点，有利于工业化放大生产，降低生产成本，为紫丁香苷工业化生产提供了重要的依据。