本发明涉及生物，特别涉及一种产泛解酸的重组微生物及其构建方法，以及该重组微生物在发酵制备d-泛解酸中的应用。
背景技术：
1、泛酸钙又称维生素b5，是人体必需的13种维生素之一，只能在微生物和植物中合成，是合成辅酶a的重要前体和维持生物正常生理机能的必需维生素。同时，泛酸钙作为食品添加剂和医药原料药等也具有广泛的应用。目前，泛酸钙主要是通过生物或化学方法拆分dl-泛解酸内酯获得高纯度d-泛解酸内酯后与β-丙氨酸反应获得。由于石化技术制备泛解酸内脂的过程中使用剧毒或强酸/碱试剂、生产过程产生大量废水/气等对环境造成巨大的破坏，dl-泛解酸内脂的手性拆除增加成本等，使得泛酸钙合成企业经常受到环保督察，泛酸钙价格也从一吨几万到几十万元不等。
2、合成生物学和代谢工程的快速发展使得通过设计和构建微生物细胞工厂以可再生原料替代不可再生的石化资源、以绿色环保的发酵工艺替代石化工艺、以低成本替代高成本生产化学品成为可能并已在许多产品中获得了巨大的成功。
3、通过微生物发酵获得的泛解酸本身就是高纯度的d-泛解酸，无需后续拆分，可以直接用于和β-丙氨酸反应生成泛酸钙，这将极大的降低泛酸钙的生产成本和环保压力。而d-泛解酸的合成也是目前工业上限制泛酸钙实现生物合成的限制因素。大肠杆菌(escherichia coli)自身具有泛解酸合成路径，但基于细胞自身复杂的代谢网络调控，野生型细胞难以积累可检测浓度的泛解酸。
4、因此，提供具有遗传稳定性、无需添加诱导剂和抗生素的能够以可再生资源为原料通过生物发酵生产高纯度泛解酸的微生物细胞对于推动泛酸钙生产、降低生产成本、减少环保压力将具有重要的意义。
技术实现思路
1、在一个方面，本发明提供了一种经遗传改造的产泛解酸菌株，其具有或具有增强的nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶。
2、在一个实施方案中，本发明提供了一种经遗传改造的产泛解酸菌株，其：
3、具有或具有增强的：乙酰乳酸合成酶、二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、甘氨酸裂解酶系统(例如氨甲基转移酶和/或甘氨酸脱羧酶)、磷酸甘油酸脱氢酶、磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶和nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶的活性；并且
4、任选地，具有降低活性的或失活的：l-丝氨酸脱氨酶i、丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶、甲基乙二醛合酶、乙酸激酶、核糖激酶、缬氨酸-丙酮酸转氨酶、磷酸乙酰转移酶和/或支链氨基酸氨基转移酶；优选地，其中支链氨基酸氨基转移酶是弱化的。
5、在一个方面，本发明提供了一种产生产泛解酸菌株的方法，包括在产泛解酸菌株中赋予或增强nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶的活性。
6、在一个实施方案中，本发明提供了一种产生经遗传改造的产泛解酸菌株的方法，包括在菌株中赋予或增强：乙酰乳酸合成酶、二羟酸脱水酶、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶、2-脱氢泛酸酯-2-还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、甘氨酸裂解酶系统(例如氨甲基转移酶和/或甘氨酸脱羧酶)、磷酸甘油酸脱氢酶、磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸氨基转移酶、磷酸丝氨酸磷酸酶和nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶的活性；并且
7、任选地，降低或失活：l-丝氨酸脱氨酶i、丙酸激酶、甲酸乙酰转移酶、醇脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、乳酸脱氢酶、甲基乙二醛合酶、乙酸激酶、核糖激酶、缬氨酸-丙酮酸转氨酶、磷酸乙酰转移酶和/或支链氨基酸氨基转移酶的活性；优选地，弱化支链氨基酸氨基转移酶的活性。
8、在一个方面，本发明提供了一种产生经遗传改造的产泛解酸菌株的方法，包括：在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)、保藏号为cgmccno.21699的大肠杆菌中，用编码nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶的基因替代nadph依赖型乙酰羟基酸还原异构酶编码基因。
9、在一个方面，本发明提供了一种生产d-泛解酸的方法，包括在适于发酵生产d-泛解酸的条件下培养本发明所述的经遗传改造的泛解酸生产菌株或者根据本发明所述产生经遗传改造的泛解酸生产菌株的方法制备的经遗传改造的泛解酸生产菌株，任选包括分离纯化产生的d-泛解酸。
10、在一个方面，本发明提供了本发明所述的经遗传改造的泛解酸生产菌株或者根据本发明所述的产生经遗传改造的泛解酸生产菌株的方法制备的经遗传改造的泛解酸生产菌株在生产d-泛解酸中的用途。
11、在一个方面，本发明提供了提高产泛解酸菌株的d-泛解酸生产的方法，包括：在产泛解酸菌株中赋予或增强nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶的活性。
1.一种经遗传改造的产泛解酸菌株，其具有或具有增强的nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶，优选所述nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶来自thermacetogenium phaeum，更优选包含seq id no：9所示的氨基酸序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性且具有nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶活性的氨基酸序列。
2.权利要求1的经遗传改造的产泛解酸菌株，其：
3.权利要求2的经遗传改造的产泛解酸菌株，其中：
4.权利要求1-3任一项的经遗传改造的产泛解酸菌株，其
5.权利要求4的经遗传改造的产泛解酸菌株，其中：
6.权利要求1-5任一项的经遗传改造的产泛解酸菌株，其中：所述经遗传改造的产泛解酸菌株属于埃希氏菌属(escherichia)、肠杆菌属(enterobacter)、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌，优选为大肠杆菌，更优选地，为保藏在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)、保藏号为cgmcc no.26276的大肠杆菌。
7.一种产生权利要求1-6任一项的经遗传改造的产泛解酸菌株的方法，包括在产泛解酸菌株中赋予或增强nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶的活性，优选所述nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶来自thermacetogenium phaeum，更优选包含seq id no：9所示的氨基酸序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性且具有nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶活性的氨基酸序列。
8.权利要求7的方法，还包括，在菌株中：
9.权利要求8的方法，其中：
10.权利要求7-9任一项的方法，包括，在菌株中：
11.权利要求10的方法，其中：
12.权利要求7-11任一项的方法，其中所述菌株选自埃希氏菌属、肠杆菌属、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌，优选大肠杆菌。
13.一种产生经遗传改造的产泛解酸菌株的方法，包括：在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)、保藏号为cgmcc no.21699的大肠杆菌中，用编码nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶的基因替代nadph依赖型乙酰羟基酸还原异构酶编码基因，
14.权利要求7-13任一项的方法，其中所述经遗传改造的产泛解酸菌株为保藏在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)、保藏号为cgmccno.26276的大肠杆菌。
15.一种提高产泛解酸菌株的d-泛解酸生产的方法，包括：在产泛解酸菌株中赋予或增强nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶的活性，优选所述nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶来自thermacetogenium phaeum，更优选包含seq id no：9所示的氨基酸序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性且具有nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶活性的氨基酸序列。
16.一种生产d-泛解酸的方法，包括在适于发酵生产d-泛解酸的条件下培养权利要求1-6任一项的经遗传改造的产泛解酸菌株或者通过权利要求7-15任一项的方法获得的经遗传改造的产泛解酸菌株，任选包括分离纯化产生的d-泛解酸。
17.权利要求1-6任一项的经遗传改造的产泛解酸菌株或者通过权利要求7-15任一项的方法获得的经遗传改造的产泛解酸菌株在生产d-泛解酸中的应用。