基于CRISPR/Cas12a的大鼠细小病毒H-1株的快速荧光检测

本发明涉及一种大鼠细小病毒h-1株的检测。

背景技术：

1、大鼠细小病毒（rat parvovirus, rpv）是对实验大鼠危害最为严重的病毒之一。最初，kilham等从患肿瘤的大鼠体内首次分离到大鼠细小病毒，称为kilham大鼠病毒（kilham rat virus，krv）。随后，tollon等从经大鼠传代的人肿瘤细胞系（hep-1）分离得到第2株细小病毒，称为大鼠h-1病毒。该病毒为单链dna病毒，基因组约为5 kb。成年大鼠感染多为无症状，但感染后可通过粪便长期向外排出病毒，会污染饲料、饮水和周围环境，严重影响实验研究。我国实验动物国家标准（gb 14922.2-2011）规定大鼠h-1病毒为spf级实验大鼠必须排除的病原体。

2、目前检测大鼠h-1病毒采用的方法主要是血清学方法，国标中规定的血清学方法包括酶联免疫吸附实验（elisa），免疫酶实验（iea），免疫荧光实验（ifa）和血凝抑制实验（hia），elisa和ifa一般做大规模筛查，hia一般用来做确证实验。由于细小病毒非结构蛋白比较保守，会产生抗体间的交叉反应，因此血清学方法的特异性较差，同时血清学方法也不适用病毒在动物间急性感染时血清抗体还未转阳的情况。

3、cn105506187a公开了一种小鼠细小病毒定量pcr检测方法，该方法用特异性引物通过定量pcr检测样本中小鼠细小病毒，但荧光定量pcr法在模板浓度低时无法确定结果，灵敏度较差。cn114478710a公开了一种大鼠细小病毒rpv-1特异性vp2基因重组抗原、合成方法及试剂盒，是通过制备大鼠细小病毒特异性基因重组抗原，建立一种间接elisa方法，但间接elisa难以避免酶标二抗和抗原之间的交叉反应，存在背景干扰。

4、因此，亟需开发一种快速精准的大鼠细小病毒h-1株检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对spf级大鼠必检项目细小病毒h-1株开发一种快速高效的可视化检测方法。

2、根据本发明，提供了一种大鼠h-1病毒的荧光检测方法，其包括：

3、针对大鼠h-1病毒基因组保守序列，利用重组酶聚合酶扩增技术（rpa），筛选rpa特异性扩增引物对进行靶序列扩增，从而得到相应的rpa特异性扩增片段；

4、设计靶向于所得rpa特异性扩增片段的基于crispr/cas12a的crrna；

5、所设计的crrna介导cas12a蛋白靶向于所得rpa特异性扩增片段后激活cas12a蛋白的反式切割活性，通过5’端标记荧光基团、3’端标记淬灭基团的单链dna荧光探针将序列信息转化为用于大鼠h-1病毒荧光检测的荧光信息。

6、根据本发明，所针对的大鼠h-1病毒基因组保守序列可以为seq id no.32或seqid no.33。

7、根据本发明，所筛选的rpa特异性扩增引物对可以为p1、p5或p7，p1的正向引物序列为seq id no.1，反向引物序列为seq id no.2；p5的正向引物序列为seq id no.9，反向引物序列为seq id no.10；p7的正向引物序列为seq id no.13，反向引物序列为seq idno.14。

8、根据本发明，所设计的crrna可以为crrna4或crrna17，crrna4的序列为seq idno.18，crrna17的序列为seq id no.31。

9、根据本发明，单链dna荧光探针（ssdna bq1 reporter）的序列可以为：5’-6-fam-ttatt-bq1-3’。

10、在本发明中所使用的cas12a蛋白可以常规市购，也可以采用下述方法制备：pet-22b-ascpf1（genbank: qru95060.1）表达载体转化到bl21菌株中，在18℃~20℃低温下经iptg诱导蛋白表达，利用his-tag亲和层析和离子交换柱技术分离纯化cas12a蛋白。

11、本发明通过等温扩增技术对模板进行恒温高效扩增，利用crispr/cas12a系统识别特异序列后激活反式切割活性，在体系中加入荧光标记的ssdna bq1 reporter，使识别到的序列信息转化为荧光信息，实现了对spf级大鼠h-1病毒高灵敏度、高特异性且可视化的检测，脱离了对实验室精密仪器的依赖。

12、本发明通过对一系列扩增引物和crrna的筛选分析，最终得到了检测效率极高的crrna，缩短了大鼠h-1病毒的检测时间，提高了检测灵敏度，最低可检测单拷贝的大鼠h-1病毒，这些优势使本发明开发的基于crispr/cas12a的大鼠细小病毒h-1株的检测方法特别适用于spf级大鼠的快速检测。

技术特征：

1.一种大鼠h-1病毒的荧光检测方法，包括：

2.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其中所针对的大鼠h-1病毒基因组保守序列为seq id no.32或seq id no.33。

3.根据权利要求2所述的荧光检测方法，其中所筛选的rpa特异性扩增引物对为p1、p5或p7，p1的正向引物序列为seq id no.1，反向引物序列为seq id no.2；p5的正向引物序列为seq id no.9，反向引物序列为seq id no.10；p7的正向引物序列为seq id no.13，反向引物序列为seq id no.14。

4.根据权利要求3所述的荧光检测方法，其中所设计的crrna为crrna4或crrna17，crrna4的序列为seq id no.18，crrna17的序列为seq id no.31。

5.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其中单链dna荧光探针的序列为：5’-6-fam-ttatt-bq1-3’。

技术总结
基于CRISPR/Cas12a的大鼠细小病毒H‑1株的快速荧光检测，包括：针对大鼠H‑1病毒基因组保守序列，利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA），筛选RPA特异性扩增引物对进行靶序列扩增，从而得到相应的RPA特异性扩增片段；设计靶向于所得RPA特异性扩增片段的基于CRISPR/Cas12a的crRNA；所设计的crRNA介导Cas12a蛋白靶向于所得RPA特异性扩增片段后激活Cas12a蛋白的反式切割活性，通过5’端标记荧光基团、3’端标记淬灭基团的单链DNA荧光探针将序列信息转化为用于大鼠H‑1病毒荧光检测的荧光信息。本发明实现了对SPF级大鼠H‑1病毒的高灵敏度、高特异性且可视化检测，脱离了对实验室精密仪器的依赖。

技术研发人员：马元武,孔维宁,张旭,齐晓龙,吕丹,李克如,向志光,苏磊
受保护的技术使用者：中国医学科学院医学实验动物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15