一种检测人类SLCO1B1基因多态性的引物探针组、试剂盒及检测方法和应用与流程

本技术属于一种生物医学领域临床检测技术中的核酸检测，具体是涉及到一种检测人类slco1b1基因多态性的引物探针组、试剂盒及检测方法和应用

背景技术：

1、辛伐他汀(simvastatin)是一种口服降血脂药物，可用于治疗高脂血症、冠心病等患者。辛伐他汀可降低正常的和升高的低密度脂蛋白胆固醇水平，还可降低极低密度脂蛋白和甘油三酯，并升高高密度脂蛋白胆固醇。辛伐他汀除了预防心血管疾病，还能够改善肝微血管功能障碍，延缓纤维化现状，预防低血容量性休克后的肝损伤等。

2、目前认为辛伐他汀是改善肝功能最有效的他汀类药物。辛伐他汀相关的肌肉不良反应包括肌病、横纹肌溶解等。导致这些不良反应的原因中，slco1b1基因多态性是导致辛伐他汀肌肉不良反应个体化差异的主要原因之一。与野生型个体相比，携带slco1b1功能异常基因的个体的肝细胞药物摄取受损，导致药物血浆暴露显著增加，可能增加肌病的发生风险。因此对slco1b1基因多态性的研究显得尤为重要。

3、目前对于slco1b1基因已有的检测方法，在推广上或多或少都存在如试剂检测成本高，操作复杂，易产生污染，产生一定的假阴性和假阳性等缺陷。其中直接测序法，虽然是snp位点分析的金标准，但该检测方法受到测序仪器的限制，测序仪器昂贵，推广困难。另外直接测序对模板量要求高，通常需要通过pcr扩增富集目的片段后，进行测序，操作复杂，周期长，且为开管操作，容易造成污染。

4、基因芯片杂交法，操作步骤烦琐，易出错，实验耗时4个小时以上并且pcr结束后需开管操作，易造成污染的问题。此外，该检测方法用肉眼来对结果进行判读，导致准确性会受到影响，导致检测结果中出现假阳性、假阴性的判读结果。

5、pcr探针分型法虽然具有操作简单，分型准确，全程闭管操作，检测周期短等特点，是目前比较主流的snp分型方法。但是目前市面上已有通过cfda认证的成型检测试剂盒，其产品扩增曲线很容易产生翘尾现象，导致假阳性的产生。

6、pcr-rflp法将pcr与限制性酶切相结合的传统方法，由于酶切操作繁琐及污染风险已经很少在临床使用。

7、因此，急需一种操作简便、灵敏准确、成本低且能实现快速检测人类slco1b1基因多态性的检测方法。

技术实现思路

1、为了解决上述至少一种技术问题，本技术提供一种检测人类slco1b1基因多态性的引物探针组、试剂盒及检测方法和应用。

2、第一方面，本技术提供一种检测人类slco1b1基因多态性的引物探针组，包括用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的引物探针组a、用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的引物探针组b以及内标actin基因的引物探针组c；

3、其中，所述用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的引物探针组a包括：

4、上游引物slco1b1-388-f：其基因序列如seq id no.1所示；

5、下游引物slco1b1-388-r：其基因序列如seq id no.2所示；

6、荧光探针slco1b1-388-p：其基因序列如seq id no.3所示；

7、所述用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的引物探针组b包括：

8、上游引物slco1b1-521-f：其基因序列如seq id no.4所示；

9、下游引物slco1b1-521-r：其基因序列如seq id no.5所示；

10、荧光探针slco1b1-521-p：其基因序列如seq id no.6所示；

11、所述内标actin基因的引物探针组c包括：

12、上游引物actin-f：其基因序列如seq id no.7所示；

13、下游引物actin-r：其基因序列如seq id no.8所示；

14、荧光探针actin-p：其基因序列如seq id no.9所示；

15、所述荧光探针slco1b1-388-p、荧光探针slco1b1-521-p、荧光探针actin-p中，5'端方向一侧连接碱基携带荧光报告基团；3'端方向一侧连接碱基携带荧光淬灭基团。

16、通过采用上述技术方案，本技术提高了检测精确度。其机理在于：本技术首先针对人类slco1b1基因设计了特异性强的引物探针组，包括用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的上游引物slco1b1-388-f、下游引物slco1b1-388-r、荧光探针slco1b1-388-p；用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的上游引物slco1b1-521-f、下游引物slco1b1-521-r以及荧光探针slco1b1-521-p；同时设计了检测人类actin基因的引物探针组，包括上游引物actin-f、下游引物actin-r、荧光探针actin-p。在本技术中，检测人类actin基因的引物探针组为内标引物探针组，其作用为，检测整个反应体系是否正常。

17、可选的，所述荧光探针slco1b1-388-p中，5'端方向一侧连接碱基，携带荧光报告基团vic，3'端方向一侧连接碱基，携带荧光淬灭基团bq145；

18、所述荧光探针slco1b1-521-p中，5'端方向一侧连接碱基携带荧光报告基团fam，3'端方向一侧连接碱基携带荧光淬灭基团bq1 55；

19、所述荧光探针actin-p中，5'端方向一侧连接碱基携带荧光报告基团rox，3'端方向一侧连接碱基携带荧光淬灭基团mgb。

20、第二方面，本技术提供了检测人类slco1b1基因多态性的引物探针组在生物检测领域以及制备检测人类slco1b1基因多态性的检测产品领域的应用。

21、第三方面，本技术提供了一种用于检测人类slco1b1基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包括两种pcr反应液，分别为：用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的pcr反应液和用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的pcr反应液；

22、其中，所述用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的pcr反应液包括seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.7、seq id no.8以及seq id no.9；

23、所述用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的pcr反应液包括seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9。

24、通过采用上述技术方案，本技术降低了检测成本，同时操作简便。其机理在于：本技术通过提供一种基于pcr熔解曲线法快速检测人类slco1b1基因多态性的检测试剂盒，解决了传统检测技术和成品检测试剂盒存在的检测仪器价格高，操作复杂，易污染，检测成本高，临床应用推广难等问题。

25、可选的，所述pcr反应液还包括dntps、氯化镁溶液以及dna聚合酶。

26、可选的，所述用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的pcr反应液中，seq idno.1和seq id no.7终浓度为0.05～0.4μmol/l，seq id no.2和seq id no.8终浓度为0.05～0.4μmol/l，seq id no.3和seq id no.9终浓度为0.05～0.4μmol/l；

27、所述用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的pcr反应液中，seq id no.4和seq id no.7终浓度为0.05～0.4μmol/l、seq id no.5和seq id no.8终浓度为0.05～0.4μmol/l、seq id no.6和seq id no.9终浓度为0.05～0.4μmol/l。

28、优选的，所述用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的pcr反应液中，seq idno.1和seq id no.7终浓度为0.1μmol/l，seq id no.2和seq id no.8终浓度为0.1μmol/l，seq id no.3和seq id no.9终浓度为0.1μmol/l；

29、所述用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的pcr反应液中，seq id no.4和seq id no.7终浓度为0.1μmol/l、seq id no.5和seq id no.8终浓度为0.1μmol/l、seq idno.6和seq id no.9终浓度为0.1μmol/l。

30、可选的，所述试剂盒还包括阳性对照组；

31、其中，所述阳性对照组包括slco1b1基因388位点野生型质粒、slco1b1基因388位点突变型质粒、slco1b1基因521位点野生型质粒、slco1b1基因521位点突变型质粒、内标基因质粒dna。

32、第四方面，本技术提供了一种用于检测人类slco1b1基因多态性的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

33、s1、提取样本中的基因组dna；

34、s2、稀释基因组dna并进行荧光pcr扩增反应；

35、s3、荧光pcr扩增反应结束后，根据pcr扩增的结果进行判读，得出slco1b1各个位点的具体型别；

36、所述荧光pcr扩增反应包括本技术所述的一种检测人类slco1b1基因多态性的引物探针组。

37、通过采用上述技术方案，本技术采用上述样本处理方法对待测样本进行检测，整个实验操作简便、成本低，检测精确度高。同时本技术所选择的引物探针组特异性强，结果易于判读，对仪器的要求不高，并且整个pcr过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使结果更加精准。

38、优选的，所述荧光pcr扩增反应所需的反应条件为如下：95℃、10min；95℃、30sec；58℃、1min；95℃、2min；40℃、1min；40℃～90℃；37℃、1min。

39、通过采用上述技术方案，本技术解决了现有技术中存在的检测精确度不高的问题。其机理在于：本技术通过逐渐增加温度的同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线，随着反应中双链dna变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上又特征峰，所以用这个特征峰就可以将特异产物与其他的产物分开。这项样本处理方法主要优势在于，可以利用不同荧光通道和不同荧光探针熔解峰温度的组合同时检测多个检测位点，从而大大节约了检测的时间与成本，与既往的taqman终点荧光法相比，不仅可以在一个荧光通道上检测多个位点，而且设计良好的探针可以通过熔解峰的变化分辨不同的亚型，而非仅仅区分野生型和突变型两种差异。

40、可选的，所述结果判读依据为如下：当阳性对照组均有fam、vic、rox荧光信号起线，阴性对照组均无fam、vic、rox荧光起线，待检测样本有rox荧光信号起线时，判定实验成功，可以进行后续分型判定；

41、(1)检测人类slco1b1基因388位点多态性的判读标准：

42、当vic荧光信号起线，并且vic通道熔解峰值为tm1＝49±1℃时，该样本为slco1b1基因388位点野生型；

43、当fam荧光信号起线，并且fam通道熔解峰值为tm1＝55±1℃时，该样本为slco1b1基因388位点突变型；

44、当fam、vic荧光信号均起线，同时，vic通道熔解峰值为tm1＝49±1℃、fam通道熔解峰值为tm1＝55±1℃时，该样本为slco1b1基因388位点突变型；

45、(2)检测人类slco1b1基因521位点多态性的判读标准：

46、当vic荧光信号起线，同时，vic通道熔解峰值为tm1＝49±1℃时，该样本为slco1b1基因521位点野生型；

47、当fam荧光信号起线，同时，fam通道熔解峰值为tm1＝55±1℃时，该样本为slco1b1基因521位点突变型；

48、当fam、vic荧光信号均起线，同时，vic通道熔解峰值为tm1＝49±1℃、fam通道熔解峰值为tm1＝55±1℃时，该样本为slco1b1基因521位点突变型。

49、(3)实验失败的判读标准：

50、当vic、fam和rox通道没有明显的扩增曲线，且没有熔解峰时表明实验失败。

51、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：

52、1.本技术提供的检测人类slco1b1基因多态性的引物探针组，具有特异性强的特点。

53、2.本技术提供的一种快速检测人类slco1b1基因多态性的检测试剂盒能够克服现有技术中存在的成本高、操作复杂、周期长等问题。具有成本低、操作简便、检测时间短等特点。

54、3.本技术提供本的一种样本处理方法，能够克服传统检测方法中存在的精确度不高，操作复杂，耗时长等问题。具有检测精确度高，操作简便，能够实现同时间内对待测样本不同的亚型的检测，并且具有成本低的特点。

55、4.本技术提供本的一种样本处理方法能够给患者提供辅助参考。

56、具体实施方式

57、以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

58、第一方面，本技术设计一种检测人类slco1b1基因多态性的引物探针组，包括用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的引物探针组a、用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的引物探针组b以及内标actin基因的引物探针组c；

59、其中，所述用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的引物探针组a包括：

60、上游引物slco1b1-388-f：其基因序列如seq id no.1所示；

61、下游引物slco1b1-388-r：其基因序列如seq id no.2所示；

62、荧光探针slco1b1-388-p：其基因序列如seq id no.3所示；

63、所述用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的引物探针组b包括：

64、上游引物slco1b1-521-f：其基因序列如seq id no.4所示；

65、下游引物slco1b1-521-r：其基因序列如seq id no.5所示；

66、荧光探针slco1b1-521-p：其基因序列如seq id no.6所示；

67、所述内标actin基因的引物探针组c包括：

68、上游引物actin-f：其基因序列如seq id no.7所示；

69、下游引物actin-r：其基因序列如seq id no.8所示；

70、荧光探针actin-p：其基因序列如seq id no.9所示；

71、所述荧光探针slco1b1-388-p、荧光探针slco1b1-521-p、荧光探针actin-p中，5'端方向一侧连接碱基，携带荧光报告基团；3'端方向一侧连接碱基，携带荧光淬灭基团。

72、第二方面，本技术提供上述检测人类slco1b1基因多态性的引物探针组在生物检测领域以及制备检测人类slco1b1基因多态性的检测产品领域的应用。

73、第三方面，本技术设计一种检测人类slco1b1基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包括两种pcr反应液，分别为：用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的pcr反应液和用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的pcr反应液；

74、其中，所述用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的pcr反应液包括权本技术所述的seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.7、seq id no.8以及seq idno.9；所述用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的pcr反应液包括本技术所述的seqid no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9。

75、第四方面，本技术提供上述一种检测人类slco1b1基因多态性的检测试剂盒的样本处理方法，所述试剂盒样本处理方法包括：

76、s1、提取样本：提取样本中的基因组dna；

77、s2、反应：将提取后的基因组dna度稀释至5～100ng/μl，并进行荧光pcr扩增反应；

78、s3、结果判读：荧光pcr扩增反应结束后，根据pcr扩增的结果进行判读，得出slco1b1各个位点的具体型别。

79、高脂血症通常指血清中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平升高，高密度脂蛋白胆固醇水平降低的现象。

80、全球每年约有390万人死于高胆固醇血症。申请人从中国医药查询平台查询得知，目前在针对高脂血症患者的治疗中，常用的治疗药物有洛伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀，辛伐他汀等他汀类药物。此类药物可降低胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇等血脂水平，还可能增加粥样斑块的稳定性或使斑块缩小，从而减少缺血性脑卒中、稳定型和不稳定型心绞痛发作，降低致死性和非致死性心肌梗死的发生。

81、同时，申请人发现辛伐他汀在治疗高脂血症、冠心病等患者的同时，也存在一些不良反应。不良反应包括肌病、横纹肌溶解等。其中，slco1b1基因多态性是导致辛伐他汀肌肉不良反应个体化差异的主要原因之一。与野生型个体相比，携带slco1b1功能异常基因的个体的肝细胞药物摄取受损，导致药物血浆暴露显著增加，可能增加肌病的发生风险。

82、因此，检测高脂血症患者患者slco1b1基因多态性是制定他汀类药物个体化用药方案、提高疗效、减少毒副作用的具有辅助参考作用的有效途径之一。

83、申请人通过研究发现，现有技术中，虽然针对slco1b1基因多态性的检测方法有很多，但各有优缺点。其中，直接测序法虽然是snp位点分析的金标准，但该检测方法受到测序仪器的限制，测序仪器昂贵，推广困难。另外直接测序对模板量要求高，通常需要通过pcr扩增富集目的片段后进行测序，操作复杂，周期长，且为开管操作，容易造成污染。基因芯片杂交法，操作步骤烦琐，易出错，实验耗时4个小时以上，耗时较长。pcr结束后需开管操作，易造成污染的问题。此外，该检测方法用肉眼来对结果判读，准确性会受到影响，会出现假阳性、假阴性的结果判读。pcr探针分型法，因其操作简单，分型准确，全程闭管操作，检测周期短等特点，是目前比较主流的snp分型方法。目前市面上已有通过cfda认证的成型检测试剂盒，其产品扩增曲线很容易产生翘尾现象，导致假阳性的产生。pcr-rflp法将pcr与限制性酶切相结合的传统方法，由于酶切操作繁琐及污染风险已经很少在临床使用。

84、申请人为了解决至少一种现有技术中存在的问题，首先设计了能够实现检测人类slco1b1基因多态性的特异性强的引物探针组，包括用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的引物探针组a、用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的引物探针组b以及内标actin基因的引物探针组c；

85、其中，所述用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的引物探针组a包括：

86、上游引物slco1b1-388-f的基因序列为：

87、5'-tttctaggagtcataaccataccc-3'；

88、下游引物slco1b1-388-r的基因序列为：

89、5'-tgagaattggcaattccaa-3'；

90、荧光探针slco1b1-388-p的基因序列为：

91、vic-tatttttgcaagtggaat-bq1；

92、所述用于检测人类slco1b1基因521位点多态性的引物探针组b包括：

93、上游引物slco1b1-521-f的基因序列为：

94、5'-ctggtctccagaacagaaatta-3'；

95、下游引物slco1b1-521-r的基因序列为：

96、5'-aataaattcaagacttgtattcgaa-3'；

97、荧光探针slco1b1-521-p的基因序列为：

98、fam-tcagcccatttgggtga-bq155；

99、所述内标actin基因的引物探针组c包括：

100、上游引物actin-f的基因序列为：

101、5'-ggaagttgtcaaagatggtgcc-3'；

102、下游引物actin-r的基因序列为：

103、5'-acctctgaccatccttccca-3'；

104、荧光探针actin-p的基因序列为：

105、rox-catcctccaggtcaag-mgb；

106、所述荧光探针slco1b1-388-p、荧光探针slco1b1-521-p、荧光探针actin-p中，5'端方向一侧连接碱基，携带荧光报告基团；3'端方向一侧连接碱基，携带荧光淬灭基团。

107、申请人通过设计特异性强的引物探针组，实现了检测精确度高的效果。在此基础上，申请人为了解决现有技术中存在的操作复杂和成本高等问题，设计了一种检测人类slco1b1基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包括两种pcr反应液；其中第一种pcr反应液用于检测人类slco1b1基因388位点多态性。所述用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的pcr反应液包括以下部分：上游引物slco1b1-388-f、下游引物slco1b1-388-r、荧光探针slco1b1-388-p、上游引物actin-f、下游引物actin-r、荧光探针actin-p；

108、第二种pcr反应液用于检测人类slco1b1基因521位点多态性。所述用于检测人类slco1b1基因388位点多态性的pcr反应液包括以下部分：上游引物slco1b1-521-f、下游引物slco1b1-521-r、荧光探针slco1b1-521-p、上游引物actin-f、下游引物actin-r、荧光探针actin-p。

109、可选的，所述pcr反应液还包括dntps、氯化镁溶液以及dna聚合酶。

110、通过以上试剂盒的设计，本技术申请人解决了检测成本高，操作复杂等问题，实现了成本低，操作简便的效果。

111、在此基础上，申请人为了进一步提高检测精确度，提供了一种上述检测人类slco1b1基因多态性的检测试剂盒的样本处理方法，所述试剂盒样本处理方法包括：

112、s1、提取样本：提取样本中的基因组dna；

113、s2、荧光pcr扩增反应：将提取后的基因组dna度稀释至5～100ng/μl，并进行荧光pcr扩增反应；

114、s3、结果判读：荧光pcr扩增反应结束后，根据pcr扩增的结果进行判读，得出slco1b1各个位点的具体型别。

115、可选的，所述荧光pcr扩增反应所需的反应条件为如下：95℃、10min；95℃、30sec；58℃、1min；95℃、2min；40℃、1min；40℃～90℃；37℃、1min。