一种低温等离子体辅助低共熔溶剂提取木瓜蛋白酶的方法

本发明涉及天然产物提取领域，尤其涉及一种低温等离子体辅助低共熔溶剂提取木瓜蛋白酶的方法。

背景技术：

1、木瓜，又称番木瓜，属于热带、亚热带水果，在我国南方各省被广泛种植，年产量约80万吨。木瓜蛋白酶又称木瓜酶,是一类巯基蛋白酶,广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内,其活性中心含半胱氨酸，具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解在肽键的n-端具有两个羧基的氨基酸或芳香l-氨基酸的肽键，因此在食品、医药、饲料、日化等行业得到广泛应用。

2、木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜茎叶和果实中,以未成熟果实的乳汁中为最高，木瓜果皮一般作为废弃物处理，但研究表明在木瓜不同部位提取的木瓜蛋白酶酶活性不同，木瓜果皮蛋白酶的活性及含量最高，其次是木瓜果肉蛋白酶，木瓜果瓤蛋白酶。将木瓜皮中的木瓜蛋白酶提取出来，不但能够提高木瓜皮的综合利用价值，还能多层次提高蛋白酶的经济效益。

3、目前，木瓜蛋白酶的提取工艺主要有亲和层析分离法、超滤膜分离法、沉淀分离法、萃取分离法以及絮凝法等,这些传统分离方法工艺较为复杂,而且具有耗费成本，污染严重，所用试剂量大等缺点，近几年新兴的双水相体系如聚合物/盐、聚合物/聚合物分离纯化木瓜蛋白酶存在一定的局限性，如粘度高，不可降解等对人和环境造成一定程度上的伤害。这些提取方法都存在一些局限性,很难进行工业化生产。

4、同时，在绿色化学倡议下，避免使用有害的传统有机溶剂，发展绿色的、环境友好的化学反应过程成为必然选择。因此，寻找一种工艺简单、低成本、条件温和、绿色环保的方法提取高纯度高品质木瓜蛋白酶具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了一种低温等离子体辅助低共熔溶剂提取木瓜蛋白酶的方法。与传统提取技术相比，使用低共熔溶剂技术提取木瓜蛋白酶，过程中绿色环保，无废酸废碱产生，可回收可降解，且具有成本低廉，操作简单。低温等离子体是新型非热提取技术，包含多种活性成分，如活性氧(o、o3、h2o2、-oh)、活性氮(no、no2-和no3)、带电粒子、电子和光子等，具有较强的生物活性和氧化性，使得高能粒子轰击生物细胞，使其表面产生刻蚀，该技术具有绿色、安全、快速和便捷等特点。同时，使用低温等离子体辅助提取木瓜蛋白酶，可提高酶得率和酶活率，工艺步骤简单，适宜大规模工业化生产，有较大应用前景。所述方法包括如下步骤：

2、1)将木瓜皮和低共熔溶剂水溶液混合，进行低温等离子体提取，得到提取液；

3、2)在提取液中加入保护剂，再经多级膜分离、冷冻干燥，制得木瓜蛋白酶。

4、本发明利用低共熔溶剂与木瓜浆混合，低共熔溶剂对蛋白质有良好的溶解性，避免了传统方法中大量有机溶剂的使用，在降低生产成本的同时达到绿色环保的效果。

5、本发明中使用的由氢键受体和氢键供体组成的低共熔溶剂是一种新型溶剂，合成简单快速、绿色无污染、可生物降解、价格低廉。氢键形成倾向较高的氢键供体往往更有利于提高酶活性，因此选择氢键形成倾向较高的受体与供体：氢键受体选择氯化胆碱、氨基酸，氢键供体选择葡萄糖、甘油、聚乙二醇、乙二醇、正丙醇、丙二醇、丁二醇。

6、进一步的，所述低共熔溶剂由氢键供体和氢键受体组成，所述氢键受体为氯化胆碱、氨基酸中的一种，氢键供体为葡萄糖、甘油、聚乙二醇、乙二醇、正丙醇、丙二醇、丁二醇中的一种或多种。

7、优选的，所述低共熔溶剂的氢键受体选用氯化胆碱。氯化胆碱有如下优点：

8、(1)成本低。根据dess的合成机理与绿色化学的原则，优先选择廉价易得、环境友好的绿色材料。相当便宜，常作为氢键受体用于合成dess。

9、(2)氯化胆碱类低共熔溶剂对蛋白质有良好的保护作用。

10、(3)基于氯化胆碱为基底组成的dess有大量氢键，对提取蛋白质有利。

11、(4)可重复使用。可以重复使用5个以上循环而不会有明显损失。

12、进一步优选的，当所述低共熔溶剂的氢键受体选用氯化胆碱时，所述低共熔溶剂的氢键供体选用甘油。

13、进一步的，所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为1：(1-4)。

14、优选的，所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为1：3。

15、进一步的，相对于1g的木瓜皮样品，所述低共熔溶剂的用量为10-60ml。

16、优选的，相对于1g的木瓜皮样品，所述低共熔溶剂的用量为40ml。

17、进一步的，所述低共熔溶剂的制备方法是将所述氢键受体与氢键供体按照摩尔比1：(1-4)混合，于60-100℃搅拌1-2h至澄清均一相，即可得到低共熔溶剂。

18、优选的，所述低共熔溶剂的制备方法是将所述氢键受体与氢键供体按照摩尔比1：(1-4)混合，于65℃搅拌1-2h至澄清均一相。

19、本发明利用低温等离子辅助低共熔溶剂提取木瓜蛋白酶，相较于单一使用低共熔溶剂提取方法，通过低温等离子体处理，使高能粒子轰击生物细胞，使其表面产生刻蚀，在较短时间内导致细胞壁破裂，增大蛋白质与低共熔溶剂接触面积，提高低共熔溶剂溶解蛋白质速率，缩短提取时间，具有温度低、快速无残留、操作简单、高效环保的特点。

20、进一步的，所述低温等离子体的工作气体选自氩气、氦气、空气中的一种或氦气/氩气与氧气两种气体以任意比例的混合气体。

21、优选的，所述低温等离子体的工作气体选用空气。

22、进一步的，所述低温等离子体放电形式选自辉光放电、电晕放电、介质阻挡放电、射频放电、滑动电弧放电、射流放电中的一种。

23、优选的，所述低温等离子体放电形式选用介质阻挡放电。

24、进一步的，所述低温等离子体等离子体工作电压为15-45v，处理时间为1-4min。

25、优选的，所述低温等离子体的处理时间为2min。

26、进一步的，所述保护剂为半胱氨酸，木瓜浆溶液中所述保护剂浓度为0.01-1.5mol/l；或保护剂为dtnb硝基苯甲酸二硫化合物与edta、抗坏血酸、环糊精或麦芽糊精中的一种或几种的混合物，木瓜浆溶液中所述保护剂浓度为0.01-1.5mol/l；向提取液中加入保护剂是为了保护木瓜蛋白酶，防止酶后续反应过程中失活。

27、进一步的，所述多级膜分离技术的膜选用陶瓷膜，加入保护剂的提取液采用0.02微米陶瓷膜微滤去除提取液中的杂质及不溶性成分，过滤后滤液用14纳米陶瓷膜超滤胶体、多肽等大分子有机物得到滤液，最后用10纳米陶瓷膜纳滤分离小分子杂质，得到截留液，冷冻干燥得到木瓜蛋白酶。

28、进一步的，所述的冷冻干燥为-10℃～-40℃干燥8～12h。

29、优选的，所述的冷冻干燥为工艺参数设置-30℃干燥12h。

30、另一方面，本发明提供了一种低共熔溶剂用于提取木瓜蛋白酶的用途，所述低共熔溶剂由氢键供体和氢键受体组成，所述氢键受体为氯化胆碱、氨基酸中的一种，氢键供体为葡萄糖、甘油、聚乙二醇、乙二醇、正丙醇、丙二醇、丁二醇中的一种或多种；所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为1：(1-4)；相对于1g的木瓜皮样品，所述低共熔溶剂的用量为10-60ml。

31、另一方面，本发明提供了一种低温等离子体用于提取木瓜蛋白酶的用途，所述低温等离子体用于辅助低共熔溶剂对木瓜蛋白酶的提取。所述低温等离子体的工作气体选自氩气、氦气、空气中的一种或氦气/氩气与氧气两种气体以任意比例的混合气体；所述低温等离子体的放电形式选自辉光放电、电晕放电、介质阻挡放电、射频放电、滑动电弧放电、射流放电中的一种；低温等离子体等离子体工作电压为15-45v，处理时间为1-4min。

32、本发明的有益效果包括：

33、1.低温等离子体辅助低共熔溶剂从木瓜皮中提取木瓜蛋白酶可得到高质量高活性蛋白酶，增加木瓜的利用价值，并推进木瓜加工废弃物的综合利用，减少环境污染，避免资源浪费，适宜大规模工业化应用，多层次提高经济效益。

34、2.本发明利用低共熔溶剂与木瓜浆混合，低共熔溶剂对蛋白质有良好的溶解性，避免了传统方法中大量有机溶剂的使用。本发明中使用的由氢键受体和氢键供体组成的低共熔溶剂是一种新型溶剂，合成简单快速、绿色无污染、可生物降解、价格低廉。能够在降低生产成本的同时达到绿色环保的效果。

35、3.本发明利用低温等离子辅助低共熔溶剂提取木瓜蛋白酶，相较于单一使用低共熔溶剂提取方法，通过低温等离子体处理，使高能粒子轰击生物细胞，使其表面产生刻蚀，在较短时间内导致细胞壁破裂，增大蛋白质与低共熔溶剂接触面积，提高低共熔溶剂溶解蛋白质速率，缩短提取时间，具有温度低、快速无残留、操作简单、高效环保的特点。此外在低温下处理，避免了木瓜蛋白酶在高温下发生变性。

36、4.使用低温等离子体辅助提取木瓜蛋白酶，可提高酶得率和酶活率；工艺步骤简单，适宜大规模工业化生产，有较大应用前景。