全合成酮还原酶及应用该酮还原酶的制备方法与流程

本发明涉及合成，特别是涉及基因工程与酶工程合成，具体而言，涉及全合成酮还原酶及应用该还原酶的制备方法。

背景技术：

1、手性醇化合物作为天然产物和手性药物合成中的重要中间体化合物，其合成一直是本领域技术人员研究的热点。手性化合物合成中手性中心的构建是合成中的关键环节，不同的手性化合物其药理活性、代谢及毒性都有着重大差异。对于手性药物，通常一组对映体中，一个是活性有效的，而另一个是无效，甚至是有毒的。

2、譬如，替格瑞洛合成中的关键中间体化合物(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇和富马酸丙酚替诺福韦合成中的关键中间体化合物(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤都是手性中间体，其光学纯度在目标药物化合物的制备中起着至关重要的作用。

3、还原酶作为生物催化剂在生物法合成中具有重要作用。但是在还原酶的应用中，能否异源表达，表达效果好坏，以及能否有效、高效催化底物转化为目标光学手性化合物，都需要具体问题具体分析。在现有技术中，还原酶往往只能单一作用在某一底物转化合成中，针对不同的手性化合物的需要，必须要构建不同的催化酶。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种全合成酮还原酶，并利用该全合成酮还原酶作为生物催化剂，提供一种新的合成替格瑞洛合成关键中间体化合物(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇和合成富马酸丙酚替诺福韦关键中间体化合物(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的方法，进而不仅得到高光学纯度的目标化合物，同时能够实现一酶两用。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种酮还原酶，所述酮还原酶的氨基酸序列如seq id no：1所示。

3、同时，本发明还公开了该酮还原酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seqid no：2所示。

4、同时，本发明还公开了一种连接有上述编码基因的重组质粒。优选地，该重组质粒为pet-28a(+)。

5、进一步地，在本发明中还公开了重组质粒的构建方法，分别设计如seq id no：3所示的上游引物p1和如seq id no：4所示的下游引物p2，将pet-28a(+)质粒bamh i和xhoi双酶切处理后，将经pcr扩增的含有bamh i和xhoi酶切位点含有如seq id no：2所示的编码基因的目的基因与载体pet-28a(+)连接，所用连接体系为目的基因4μl，载体pet-28a(+)2μl，buffer 2μl，连接酶1μl，16℃过夜。

6、进一步地，本发明还公开了pcr扩增的条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环；pcr扩增体系：模板1.5μl，上下游引物各1.5μl，灭菌的双蒸水20.5μl，primerstarmix25μl；其中模板为puc57。

7、同时，本发明还公开了含有上述重组质粒的宿主细胞。优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。

8、另一方面，本发明还公开了应用该酮还原酶的制备化合物(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法，将重组工程菌培养、破碎后添加至含有底物化合物ⅱ、nadp+、异丙醇和异丙醇还原酶酶粉的反应体系中，经反应形成化合物ⅰ，所述重组工程菌是以e.colibl21(de3)为宿主，pet-28a(+)为载体，表达如seq id no：1所示的酮还原酶的大肠杆菌，

9、

10、在另一个发明，本发明还公开了应用该酮还原酶制备化合物(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的方法，将重组工程菌培养、破碎后添加至含有底物化合物ⅳ、nadp+、异丙醇和异丙醇还原酶酶粉的反应体系中，经反应形成化合物ⅲ，所述重组工程菌是以e.colibl21(de3)为宿主，pet-28a(+)为载体，表达如seq id no：1所示的酮还原酶，

11、

12、进一步优选地，所述重组工程菌培养方法如下：将重组菌接种于培养基中，37℃震荡培养过夜，按照2％的接种量转接于lb培养基中，37℃培养至od600＝0.6时，加入50μl0.5mol/l的诱导剂，16～25℃诱导16h，离心收集菌体。

13、进一步优选地，所述重组工程菌采用超声波破碎的方式，超声功率为260w，超声程序为运行3s，间隔5s，总时长3min。

14、进一步优选地，所述酮还原酶在反应体系中的浓度为0.04g/ml。

15、本发明通过全合成的方法获得了一种新的酮还原酶，该酮还原酶能够稳定异源功能性表达，同时该酮还原酶能够在替格瑞洛合成关键中间体化合物(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的制备中和富马酸丙酚替诺福韦关键中间体化合物(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的制备中均表现出高效地催化活性，具有巨大的工业化应用潜力，有望成为催化不同手性构型的通用酮还原酶。

技术特征：

1.一种酮还原酶，其特征是，所述酮还原酶的氨基酸序列如seq id no：1所示。

2.一种dna分子，其特征是，所述dna分子含有编码权利要求1所述的酮还原酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

3.一种重组质粒，其特征是，所述重组质粒连接有权利要求2所述的dna分子，进一步优选地，该重组质粒为pet-28a(+)。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征是，所述重组质粒是通过以下方法构建，分别设计如seq id no：3所示的上游引物p1和如seq id no：4所示的下游引物p2，将pet-28a(+)质粒bamh i和xhoi双酶切处理后，将经pcr扩增的含有bamh i和xhoi酶切位点含有如seq id no：2所示的编码基因的目的基因与载体pet-28a(+)连接，所用连接体系为目的基因4μl，载体pet-28a(+)2μl，buffer 2μl，连接酶1μl，16℃过夜。

5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征是，pcr扩增的条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环；pcr扩增体系：模板1.5μl，上下游引物各1.5μl，灭菌的双蒸水20.5μl，primerstarmix25μl；其中模板为puc57。

6.一种宿主细胞，其特征是，所述宿主细胞含有上述重组质粒，优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。

7.应用权利要求1所述的酮还原酶制备化合物(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法，其特征是，将重组工程菌培养、破碎后添加至含有底物化合物ⅱ、nadp+、异丙醇和异丙醇还原酶酶粉的反应体系中，经反应形成化合物ⅰ，所述重组工程菌是以e.colibl21(de3)为宿主，pet-28a(+)为载体，表达如seq id no：1所示的酮还原酶的大肠杆菌，

8.应用权利要求1所述的酮还原酶制备在化合物(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的方法，将重组工程菌培养、破碎后添加至含有底物化合物ⅳ、nadp+、异丙醇和异丙醇还原酶酶粉的反应体系中，经反应形成化合物ⅲ，所述重组工程菌是以e.colibl21(de3)为宿主，pet-28a(+)为载体，表达如seq id no：1所示的酮还原酶，

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征是，所述重组工程菌培养方法如下：将重组菌接种于培养基中，37℃震荡培养过夜，按照2％的接种量转接于lb培养基中，37℃培养至od600＝0.6时，加入50μl0.5mol/l的诱导剂，16～25℃诱导16h，离心收集菌体。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征是，所述重组工程菌采用超声波破碎的方式，超声功率为260w，超声程序为运行3s，间隔5s，总时长3min。

11.根据权利要求7或8所述的方法，其特征是，所述酮还原酶在反应体系中的浓度为0.04g/ml。

技术总结
本发明涉及合成技术领域，特别是涉及基因工程与酶工程合成技术领域，具体而言，涉及全合成酮还原酶及应用该还原酶的制备方法。通过全合成的方法获得了一种新的酮还原酶，该酮还原酶能够稳定异源功能性表达，同时该酮还原酶能够在替格瑞洛合成关键中间体化合物(S)‑2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙醇的制备中和富马酸丙酚替诺福韦关键中间体化合物(R)‑9‑(2‑羟丙基)腺嘌呤的制备中均表现出高效地催化活性，具有巨大的工业化应用潜力，有望成为催化不同手性构型的通用酮还原酶。

技术研发人员：戚陈陈,邬小兵,张康,杨柳
受保护的技术使用者：重庆普佑生物医药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15