抗cCRP抗体或其功能性片段及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及抗ccrp抗体或其功能性片段及其应用。

背景技术：

1、机体在受到创伤、感染等刺激时，会出现急性期反应，受到刺激的巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞会释放出多种促炎因子，促进肝脏合成急性期反应蛋白。常见的急性期反应蛋白包括c反应蛋白、血清淀粉样本蛋白、触珠蛋白等。c反应蛋白是犬主要的急性反应期蛋白，具有快速合成、快速下降的特点。犬c反应蛋白的含量在健康犬体内为<10mg/l，在炎症刺激后的4到6小时内升高，48小时可达到峰值，此时，血清中该蛋白的浓度比正常值升高约100-1000倍。当全身炎症消退后，可在24小时内减少50％，所以，犬c反应蛋白对感染早期判断具有很强敏感性。另外，通过检测犬血清中crp的含量，可用来鉴别细菌感染、病毒感染、血液寄生虫感染、创伤性疾病、肿瘤等疾病的辅助诊断。因此，临床上犬crp(ccrp)已经作为一种全身性炎症和疾病发展的监控指标。

2、目前，临床上血清中犬c反应蛋白的检测一般采用单向免疫扩散法、酶联免疫法及胶乳比浊法等免疫检测方法，而免疫检测方法的灵敏度和准确性很大程度上依赖与抗原抗体的反应性，因此性能优良的单克隆抗体十分重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供抗ccrp抗体或其功能性片段，实现与犬c反应蛋白的特异性结合，并最终应用到能够快速、准确检测犬炎症反应的免疫检测产品中。

2、具体如下：

3、抗ccrp抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：

4、cdr-vh1：x1-y-x2-v-h，其中x1是t或n，x2是r或g；

5、cdr-vh2：x1-i-n-p-s-s-g-x2-t-n-y-n-q-x3-f-k-h，其中x1是s或v，x2是n或s，x3是i、k或a；

6、cdr-vh3：s-d-y-x1-g-s-n-i-f-d-x2，其中x1是y或d，x2是y；

7、cdr-vl1：r-a-s-x1-n-i-y-y-s-x2-a，其中x1是e或q，x2是l或v；

8、cdr-vl2：x1-a-n-x2-l-e-d，其中x1是y、w或n；x2是s；

9、cdr-vl3：k-q-x1-y-d-x2-p-p-t，其中x1是a或y，x2是c或v。

10、进一步地，所述互补决定区的cdr-vh1中x2是r，cdr-vh2种x1是s，cdr-vh3种x2是y，cdr-vl1种x1是e，cdr-vl2中x2是s，cdr-vl3中x1是a。

11、本发明所述cdr区段划分采用kabat算法。

12、“cdr”在本文中用于指抗体可变序列内的“互补决定区”。重链和轻链的可变区各有3个cdr，从重链或轻链的n端开始。

13、抗原结合位点可以包括六个cdr(本发明中的cdr-vh1、cdr-vh2、cdr-vh3、cdr-vl1、cdr-vl2和cdr-vl3)。包含单个cdr(例如cdr-vh1、cdr-vh2、cdr-vh3、cdr-vl1、cdr-vl2活cdr-vl3)的多肽可称为“分子识别单元”。抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明cdr的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链cdr3。因此，分子识别单元可能主要负责抗原结合位点的特异性。一般而言，cdr残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。

14、本发明的发明人发现，在各互补决定区中的上述突变位点为上述氨基酸残基时，该抗体对ccrp具有更好的亲和力。

15、在可选的实施方式中，所述cdr-vh1中x1是t；

16、在可选的实施方式中，所述cdr-vh1中x1是n；

17、在可选的实施方式中，所述cdr-vh1中x2是r；

18、在可选的实施方式中，所述cdr-vh1中x2是g；

19、在可选的实施方式中，所述cdr-vh2中x1是s；

20、在可选的实施方式中，所述cdr-vh2中x1是v；

21、在可选的实施方式中，所述cdr-vh2中x2是n；

22、在可选的实施方式中，所述cdr-vh2中x2是s；

23、在可选的实施方式中，所述cdr-vh2中x3是i；

24、在可选的实施方式中，所述cdr-vh2中x3是k；

25、在可选的实施方式中，所述cdr-vh2中x3是a；

26、在可选的实施方式中，所述cdr-vh3中x1是y；

27、在可选的实施方式中，所述cdr-vh3中x1是d；

28、在可选的实施方式中，所述cdr-vh3中x2是y；

29、在可选的实施方式中，所述cdr-vl1中x1是e；

30、在可选的实施方式中，所述cdr-vl1中x1是q；

31、在可选的实施方式中，所述cdr-vl1中x2是l；

32、在可选的实施方式中，所述cdr-vl1中x2是v；

33、在可选的实施方式中，所述cdr-vl2中x1是y；

34、在可选的实施方式中，所述cdr-vl2中x1是w；

35、在可选的实施方式中，所述cdr-vl2中x1是n；

36、在可选的实施方式中，所述cdr-vl2中x2是s；

37、在可选的实施方式中，所述cdr-vl3中x1是a：

38、在可选的实施方式中，所述cdr-vl3中x1是y；

39、在可选的实施方式中，所述cdr-vl3中x2是c；

40、在可选的实施方式中，所述cdr-vl3中x2是v。

41、优选的，所述各互补决定区选自如下突变组合中任意一种：

42、

43、

44、进一步地，所述抗体包括轻链骨架区fr1-l、fr2-l、fr3-l及fr4-l和重链骨架区fr1-h、fr2-h、fr3-h及fr4-h；所述重链骨架区fr1-h、fr2-h、fr3-h及fr4-h依次选自seq idno:1-4；所述轻链骨架区fr1-l、fr2-l、fr3-l及fr4-l依次选自seq id no:5-8。

45、进一步地，所述抗体还包含恒定区。

46、优选的，所述恒定区选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige和igd中的任意一者的恒定区，优选的，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

47、优选的，所述功能性片段选自所述抗体的vhh、f(ab’)2、fab’、fab、fv和scfv中的任意一种。

48、进一步地，所述抗体为标记抗体。

49、本发明所述“标记抗体”为标记有可被检测的标记物。

50、术语“抗体”包括各种形式的抗体结构，包括但不限于完整抗体和抗体片段。根据本发明的抗体优选是山羊、绵羊、小鼠、兔或大鼠抗体，嵌合抗体或进一步的基因工程抗体，只要保留根据本发明的特征性质。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合部位。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；单链抗体分子；scfv、sc(fv)2；双抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

51、优选的，所述可被检测的标记物包括但不限于生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物；

52、优选的，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、cy系列染料及其衍生物、alexa系列染料及其衍生物、attotm系列染料、tye系列染料、量子点和蛋白类染料及其衍生物等；；

53、所述酶为催化底物显色的酶所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。优选的，所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶；

54、优选的，所述放射性同位素包括但不限于212bi、131i、111in、90y、186re、211at、125i、188re、153sm、213bi、32p、94mtc、99mtc、203pb、67ga、68ga、43sc、47sc、110min、97ru、62cu、64cu、67cu、68cu、86y、88y、121sn、161tb、166ho、105rh、177lu、172lu和18f；

55、优选的，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物；

56、优选的，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒；

57、优选的，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；

58、优选的，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

59、另一方面，本发明公开了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有所述的抗ccrp抗体或其功能性片段。

60、优选的，所述检测试剂盒为荧光免疫层析检测试剂盒。

61、优选的，所述试剂盒检测的样本选自全血、血清、血浆、尿液或唾液的体液。

62、有益效果：

63、本发明不仅提供了一种于ccrp结合高亲和力的单克隆抗体(野生型)，还对该野生型做了多个活性突变，并验证各突变的亲和力，为免疫检测ccrp领域的研究提供了参考。