一种外泌体捕获及检测方法与流程

本发明属于外泌体捕获检测领域，涉及一种新型外泌体的富集方法，特别是涉及一种外泌体捕获及检测方法，具体涉及一种采用dna水凝胶及金属有机框架材料富集和检测外泌体的方法。

背景技术：

1、外泌体是一种由活细胞分泌，直径约为30-150 nm，来源于晚期核内体的膜性囊泡结构，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等体液中。外泌体参与个体发展的多项重要过程，如细胞增殖和迁移、新生血管生成、细胞死亡逃逸、侵袭和转移。外泌体的生物特性及内含物可以根据个体变化而响应性变化，从而导致信号通路发生变化，因此对其含量进行检测可以动态显示个体的状态变化。

2、然而，受限于实验手段和材料，目前需要对外泌体进行分离后才可对其进行数目测定。常用的外泌体分离方法有离心法、尺寸排除色谱法、共沉淀法、免疫分离法等。但是，这些方法各自具有一定的缺陷：(1)离心法，常用的为差速离心法和密度梯度离心法，用时较长，易污染，分离效率较低；(2)尺寸排除色谱法，耗时较久，可能改变外泌体形貌，不适合大量样本处理；(3)共沉淀法：易造成非囊泡污染物，影响后续分析；(4)免疫分离：不适于大量样本中分离外泌体，回收效率低。由于外泌体分离效果不佳，因此极大的影响了对外泌体含量的实时定量。

3、因此，亟需开发新的更加简单易行、操作性强的的外泌体捕获分离方法，以提高外泌体定量的准确性。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种外泌体捕获及检测方法，无需复杂的外泌体的分离与提取步骤，可采用dna水凝胶对外泌体进行富集和捕获，并进行定量检测，方法简单，稳定性强。

2、本发明提供了一种简单的外泌体富集及检测方法，基本原理为采用y型dna作为水凝胶骨架，通过dna的π-π堆积将有外泌体膜蛋白核酸适配体的单链dna（apt-ssdna）吸附在具备模拟酶活性的金属有机框架材料表面（mofs），同时抑制mofs的活性。当存在外泌体时，apt-ssdna从mofs表面解离，并与外泌体结合，释放的末端dna与y型dna末端结合形成dna水凝胶，mofs活性恢复，可以催化显色反应，从而对外泌体含量进行测定。

3、本发明提供了一种外泌体捕获方法，包括以下步骤：

4、s1，dna 1、dna 2与dna 3以1:1:1比例溶解于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，95℃反应4-10 min，缓慢降至室温以形成y型dna；

5、s2，mofs与apt-ss-dna混合均匀，mofs与apt-ss-dna的比例是1g：（3-5）μmol；室温孵育0.5-2 hr，彻底清洗未结合dna，溶解沉淀于超纯水中待用，得到apt-mofs； apt-ss-dna中的aptamer（适配器）选自任意一种外泌体膜蛋白aptamer；apt-ss-dna的序列选自dna4-dna11中的一种或者多种；mofs是任意一种具备模拟酶活性mofs材料；

6、s3，apt-mofs、外泌体、y型dna 40℃孵育30 min缓慢降温，水凝胶形成，并捕获外泌体。

7、上述dna1-11的序列如下：

8、dna 1：cacggacttg gatccgcata accattcgcc gtaatg（seq id no 1）

9、dna 2：cacggactca ttacggcgaa tgtaccgaat cagcct（seq id no 2）

10、dna 3：cacggactag gctgattcgg tagttatgcg gatcca（seq id no 3）

11、dna 4：agtccgtgta acacgacaga cgttcggagg（seq id no 4）

12、dna 5：agtccgtgcg ggtgcgacag tcccaagct（seq id no 5）

13、dna 6：agtccgtgta accaccccac ctcgctcccg（seq id no 6）

14、dna 7：agtccgtgaa ccttaatcgt aatcacagt（seq id no 7）

15、dna 8：agtccgtgca ccccacctcg ctcc（seq id no 8）

16、dna 9：agtccgtgat cgtaatcaca gtgc（seq id no 9）

17、dna 10：agtccgtgca tttgaccatc cgggtctatg（seq id no 10）

18、dna 11：agtccgtgcc gacatccggg gttggtttcc ca（seq id no 11）。

19、优选地，所述三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液可以通过添加10 mm tris-hcl，1mm 乙二胺四乙酸edta，50 mm氯化钠nacl制备， ph控制在8.0。

20、优选地，mofs与apt-ss-dna混合均匀后，孵育的条件是25℃孵育1 hr。

21、本发明的方法可以用于捕获外泌体。如果步骤s3中，在apt-mofs、外泌体、y型dna的混合物中加入显色溶液，则可以通过显色反应对外泌体进行定量。

22、优选地，所述aptamer可以为任意一种外泌体膜蛋白aptamer，较佳的为cd63、cd81膜蛋白。

23、优选地，所述mofs可以为任意一种具备模拟酶活性mofs材料，较佳的为一种共价有机框架纳米酶结构（cofs）。

24、优选地，所述显色底物可以为任意一种可被氧化的化合物，较佳的为3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）。

25、本发明中，y型dna是由三条dna单链相互杂交组成的dna，一条dna与另外两条dna分别部分互补，形成y型的结构，结构的稳定性使其在生物检测领域拥有独特的优势。apt-ssdna是apt（aptamer）与ssdna杂交形成apt-ssdna杂交分子。金属-有机框架，也称为金属有机框架，简称mofs（metal-organic frameworks），是由有机配体和金属离子或团簇通过配位键自组装形成的具有分子内孔隙的有机-无机杂化材料，通常用于可用于气体吸附、气体储存、气体分离、催化剂等领域。

26、本发明的一个实施例中，具体方法如下：

27、（1）dna 1、dna 2与dna 3以1:1:1比例溶解于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液（10 mm tris-hcl，1 mm 乙二胺四乙酸edta，50 mm氯化钠nacl， ph 8.0），95℃反应5 min，缓慢降至室温以形成y型dna。

28、（2） 1 mg/ml mofs与5 μm apt-ss-dna（dna4-11） 混合均匀后，25℃孵育1 hr，彻底清洗未结合dna，溶解沉淀于超纯水中待用，得到apt-mofs。

29、（3）取apt-mofs、外泌体、y型dna、显色溶液， 40℃孵育30 min缓慢降温，水凝胶形成，并通过显色反应对外泌体进行定量。

30、本发明的优点在于：

31、（1）本发明采用无需复杂的外泌体的分离与提取步骤，可采用dna水凝胶对外泌体进行富集和捕获，并进行定量检测。

32、（2）本发明利用aptamer特异性对外泌体进行识别，并采用纳米酶进行无酶显色检测，方法简单，稳定性强。