三维人工管状组织及其制备方法与应用与流程

本发明属于组织工程，具体涉及一种三维人工管状组织及其制备方法与应用。

背景技术：

1、组织工程(tissue engineering)是通过材料工程学和生命科学来研究生物组织的结构、功能和生长的机理，以期开发能够修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的一门交叉学科。组织工程在生物医学方面极具发展前景，实现受损组织的修复和再生是组织工程的主要目标，基于此，如何在体外培养出具有高度仿生结构的细胞支架结构物，并保证其在移植到体内后能够顺利重建出具有优良结构和功能的人工组织和器官，成为这门学科的关键。

2、人体内广泛存在着具有管状结构的生物系统，主要包括血管系统、消化系统、呼吸系统、神经系统和生殖系统。常见的管状组织有气管、血管、淋巴管、食道管、神经导管、尿道管、肠道和生殖道等，这些中空的器官和组织驱动着身体的各种功能，发挥着各自不同的功能。因此，三维人工管状组织也存在各种各样的结构和功能，利用组织工程构建各类仿生管状组织时，需要考虑各种管状组织的结构差异和功能差异。

3、为了更好制备出各种具有类似真实结构和功能的仿生人工管状移植物，首先需要对各种人体管状组织和器官的结构进行全面了解。以下主要从血管系统、消化系统、呼吸系统和神经系统进行分别介绍。

4、血管系统的主要作用是将血液以相对较高的速度运输到全身，对血管壁产生显著的流体剪切应力。血管主要由内皮层、中膜层和外膜层三层被膜构成，其轴心为中空的腔体。血管内皮具有相对的渗透性，允许生化因子在某些疾病状态下通过血管壁甚至细胞运输。血管中膜由周向致密的平滑肌细胞(vsmcs)和弹性蛋白组成，其主要功能是承受血液流动时造成的扩张力及冲击力。血管外膜主要由胶原蛋白和成纤细胞组成，该层为疏松的结缔组织，其功能为包裹血管和支撑血管，同时赋予血管一定的抗张强度。血管中的胶原蛋白赋予其一定的强度，弹性蛋白使血管富有弹性。血管大小从直径只有几微米的毛细血管和微血管到直径可达30mm的静脉和动脉。小的毛细血管，如构成血脑屏障的毛细血管，只由一个细胞组成，包裹在自身上形成内部管腔。因此，血管的不同管状直径及结构差异使得组织工程血管的构建变得较为复杂，目前主要制备出了大口径的人工血管组织，而小口径的人工血管组织仍有待进一步攻克。

5、消化系统主要是胃肠道，胃肠道的每个部分都由四层组成，从管腔内层开始，包括黏膜、黏膜下层、固有肌层和浆膜。黏膜包含肠上皮细胞，具有吸收、分泌和保护功能。肠上皮是一个紧密的屏障系统，可以将管腔内部内容物与周围组织隔开，肠上皮组织具有复杂的3d结构，与管腔突出(称为绒毛)和中间内陷(称为隐窝)，这种3d结构使内部表面积最大化，有助于营养的吸收。黏膜下层有一系列的免疫细胞、神经和淋巴细胞，这一层被固有肌层包围，它通过肌肉细胞提供蠕动泵，执行肠道运动的关键功能。最外层是浆膜(或外膜)，它在胃肠道周围形成一个屏障。肠道还拥有一系列复杂的神经，称为肠神经系统，包括两个平行的神经丛、粘膜下神经丛和肌肠神经丛。因此，胃肠道的复杂结构进一步使得人工消化道组织的设计变得极为复杂化。

6、呼吸系统包括上呼吸道和下呼吸道，其中气管是吞咽、说话和呼吸的基础，位于上呼吸道(鼻腔、咽喉、咽部)下方，是下呼吸道(气管、支气管、细支气管、肺泡)的一部分。气管主要由以下四层组成：粘膜、粘膜下层、透明软骨和外膜。粘膜含有假分层上皮，排列在管腔内，包含多种细胞类型。粘膜下层是结缔组织层，包含粘膜下腺体，有助于粘液的分泌。软骨层由马蹄形透明软骨环组成，纤维弹性组织与之连接，纤维弹性组织后方由纵向定向的平滑肌组成的膜状结构闭合。最后，外膜由结缔组织组成，软骨和外膜层都是形成气管独特结构和力学特性的基础。外膜还包含许多其他类型的细胞，如成纤维细胞、脂肪细胞、神经和与血管系统的连接，这是满足血液、营养和代谢需求所必需的。与血管系统和肠道的体外模型不同，气管容易受到感染、狭窄、塌陷或癌症导致的一系列气道紊乱的影响，到目前为止，气管组织工程主要关注用于气管置换的可植入支架。

7、神经系统对人体至关重要，负责机体生理功能活动和内环境的调节，分为中枢神经系统和周围神经系统。中枢神经系统主要为人体的综合行为提供指令；周围神经系统主要指导人体感知和运动。神经系统受损将会造成视觉、听觉、嗅觉等感知能力的丧失，或是咀嚼、行走、抓握等运动能力的丧失，以及痴呆、眩晕、失忆等意识障碍，会对人体健康带来极大冲击。构成神经系统的主要成分是神经组织，而神经组织由神经元和神经胶质细胞组成。与生物体内普通细胞不同，神经元的长短不一，从几微米到一米不等，该现象归因于神经元的两个特殊突起结构(轴突和树突)。神经胶质在神经组织中的占比较大，细胞体也有不规则突起，其主要作用为支撑神经元、信号绝缘、提供营养和保护等。整个神经呈现出三层结构，神经截面呈现扁平状。因此，要实现组织工程神经支架的高度仿生，首先要从模拟神经组织的组成结构开始。

8、虽然人类对各种生命系统和组织早就有所了解，然而人类在体外培养细胞并尝试构建人工组织和器官仍然经历了漫长的发展历程。自从1885年willhelm roux从鸡胚中分离细胞，就首次建立了体外细胞培养的思路。起初传统的细胞培养方法一直是在二维平面上培养，并经历了很长一段时间的发展。然而人们发现，这种细胞单层培养方式，由于体外环境的改变，细胞增殖过程中逐渐丧失了原有的性状，和体内的情况有所不符，在三维组织中生长的细胞与单层结构细胞、悬浮细胞有着明显的差别。

9、大量研究表明，细胞在真实三维组织中的环境和行为要比二维平面上更为复杂。与二维平面培养相比，三维立体培养的细胞在形态学、生物化学、蛋白质、基因表达等很多方面都有高度复杂性，体外三维培养环境比二维培养环境更有利于细胞功能的保持和发挥，让细胞在空间立体环境下生长，能够更接近于体内生长模式，更有利于形成与体内组织类似的结构，从而发挥其功能。因此，细胞的三维培养技术应运而生，到目前为目已经经过了几十年的发展。

10、三维细胞培养技术(three-dimensional cell culture，tdcc)是指将具有三维结构的不同材料载体与不同种类的细胞在体外共培养，使细胞能够在载体的三维结构中生长和迁移，最大程度地模拟体内细胞生长环境，使细胞更接近于体内生长模式。在20世纪上半叶，学者holtfreder及其同事创造性的建立了体外三维细胞培养方法，为后来的三维培养技术奠定了基础。到20世纪50年代，学者moscona及其同事率先采用了三维培养方法来研究癌细胞的增殖、分化和聚集。近几十年来，三维培养技术得到了广泛研究和发展，并已经大量应用于肿瘤研究领域。

11、人工组织的构建一般涉及三大要素：种子细胞、支架材料和细胞与材料的体外构建。然而，由于真实人体管状组织的生理结构十分复杂，种类也较多，各种管状组织发挥着不同的功能，因此需要结合各种因素才能产生所需组织的近似模型，这对人工管状组织的开发带来了极大的挑战。

12、首先，必须考虑细胞的来源和类型，任何管状系统都需要上皮细胞的来源，然而这些细胞的确切行为取决于所涉及的不同组织。上皮细胞通常与产生细胞外基质(ecm)的细胞如成纤维细胞或平滑肌细胞共同培养，但即使是基质生产细胞的类型也会因应用的不同而不同。例如，气管需要使用软骨细胞或沿软骨形成途径分化的间充质干细胞。另一方面，不同的组织也需要不同的支持细胞，例如，原生肠上皮含有分泌粘液的杯状细胞，原生血管和肠道都有一层肌肉组织，需要获取适当的肌肉细胞。

13、其次，支架的设计同样具有挑战性。首先需要创建一个支持细胞生长的结构，然后才能创建所需的组织，且不能影响合成后的整体功能。这些挑战在管状系统的设计中尤其突出，管状支架不仅需要为细胞的营养获取、生长增殖和分化代谢提供必要的三维支撑结构，还需要为细胞提供适当的化学、形态和拓扑结构信息，以引导细胞形成目标功能组织，另外还需要为细胞分泌细胞外基质并最终形成相应组织或器官提供良好的生理微环境。因此，管状支架需要具备适当的孔径和孔隙率以为营养代谢物质的输送和种子细胞的长入创造有利条件，并具备一定的力学强度，以保证再生过程中的新生组织能够保持适当的形态，使其不易为外力所破坏，且不对周边原有组织造成机械损伤。此外，支架材料本身还应该广泛易得并具备较好的生物相容性、不易引起凝血、炎症和免疫排斥等不良反应，并具有一定的可灭菌性、良好的可塑性和适宜的降解速率以适应不同组织和细胞的生长和增殖速率，从而为组织的再生提供足够的空间。这无疑为组织工程支架的开发带来诸多困难。

14、第三，细胞与支架材料之间的结合也是极为困难的，其原因主要在于：支架内存在空气、支架内存在界面力和表面张力、支架材料具有亲疏水特性以及支架形状复杂等，这些结构导致种植的细胞在支架上分布不均匀，种植位置不可控，种植效率低等问题。另一方面，管状组织的复杂结构导致细胞在支架上的生长变得更为困难。例如，上皮或内皮屏障的形成和持续完整性确保了必需满足营养物质和代谢副产物的选择性渗透，同时防止有害或致病化合物的进入。如果没有成功的屏障形成和对其特性的描述，这些模型的功能甚至细胞生存都将受到限制。

15、随着组织工程研究的不断发展，人们发现，管状组织虽然功能各异，但在结构上也有统一的特征。在这些管状组织的管腔内部有一组形成屏障的细胞，称为上皮细胞(血管系统中为内皮细胞)，其作用是将管腔的内部内容物从周围组织和器官中分离出来，同时允许选择性的渗透和运输穿过上皮细胞。基于这一点，在生产适用于不同组织工程应用的管状支架时，首先需要产生完整的管状开口和形成半透性上皮或内皮。

16、管状支架的首要要求是能够形成相邻的上皮或内皮内衬，采用细胞在二维(2d)非多孔表面或在可注射介质(如水凝胶)中均匀播种是最有效的途径。然而，管状支架通常是三维的，而非二维的，因此在3d表面上均匀播种细胞显得十分必要。有研究人员将细胞播种在平面膜上，然后将这些平面膜卷曲成管状；也有研究人员采用动态方法，依靠细胞通过旋转或加压驱动均匀地附着在周围的壁上。然而由于支架的孔隙结构使得相邻上皮的形成更为困难。另外一些研究通过分层方法将产生ecm的细胞或沉积细胞填充回孔，以辅助上皮细胞的形成；许多植入驱动的研究也依赖于体内的细胞浸润，然而这些方法都存在一定的局限性。

17、经过20余年的发展，组织工程支架的制备已获得了长足的进步，人们基于管状组织结构的特点，开发出了各种方法来生产管状支架，包括有纤维粘结法(fiberbonding)、溶剂浇铸-颗粒沥滤法(solvent casting/particulate leaching)、相分离法(phaseseparation)、原位聚合法(site polymerization)、乳化/冻干法(emulsion freezedrying)、气体发泡(gas foaming)、快速成型(rapid prototyping)、自组装(self-assembly)和静电纺丝法(electrospinning)等。

18、上述制备方法已经大量开展并用于各类三维组织的制备，然而这些方法仍然存在诸多问题无法解决。

19、如大孔径、无纺管状可降解支架培养得到的血管，其管状支架无法控制三种细胞的精准空间分布，从而无法实现更为仿生的三层结构，无法构建小于6毫米直径、且具有多层细胞结构的小口径血管。

20、如传统细胞3d种植方法，只是将一个三维拓扑结构的支架浸润在一定细胞浓度的细胞悬液中，并对其进行包括旋转、震荡在内的动态刺激培养。这种种植方法无法很好地在特定拓扑结构处实现特定细胞的培养和分化，导致无法实现类似于真实组织的特性。

21、如基于3d打印和显微镜技术研发的细胞3d打印机，融合了高分子基质和细胞的溶液喷涂重叠，可以实现打印3d结构的目的。然而为了保证打印机喷头的流畅性，细胞3d打印机使用的支架材料多为水凝胶，这导致打印出的支架很难形成具有一定机械强度的组织。另一方面，受制于水凝胶材料的限制，其无法实现诸如毛细血管或绒毛等生物结构的仿生制备。另外，该方法也无法实现大通量的组织打印。

22、在细胞种植方面，现有方法也存在细胞种植率低和细胞在支架内分布不均匀的缺点。人们虽然尝试了采用各种方法来提高细胞种植的效率和均匀性，例如灌注种植、搅拌瓶反应器种植等方式，然而这些技术在实际应用上的效果有限，在组织工程领域并未被广泛使用。

23、例如，在对天然血管多层结构的仿生化设计中，支架中结构的取向性、腔内内皮层的形成和将细胞向支架内部定殖仍然存在巨大的挑战。如何提高组织工程血管支架的远期通畅率和顺应性；如何开发具有良好生物活性以减少血栓和感染出现的生物材料；如何在支架材料机械强度、降解速率和组织形成速率三者间找到最佳的平衡点以及如何解决种子细胞来源少、体外构建自体血管时间较长的问题，均有待进一步研究。

24、为了克服上述缺陷，研究人员进行了大量工作，开发出了一系列先进的三维管状组织的构建方法，并取得了以下成果。

25、专利文献cn 102884172 b提供了一种用于无菌分离、收集细胞和将细胞种植到支架或组织移植物上的系统。该系统能够从目标分离和收集细胞，并将这些细胞种植到生物相容性的三维支架或组织移植物上，这些支架或移植物能够在用于培养、输送、存储、测试的系统内例如作为组织移植物(例如血管移植物)培育和/或植入到目标内，以在体内、体外或离体地再生和/或修复组织。然而该系统结构极为复杂，且并不适用于所有细胞的收集培养和种植，在组织工程领域仍有较大的局限性。

26、专利文献cn 106085847 b提供了一种基于3d打印技术的支架内细胞种植平台及方法，包括三维运动平台、控制系统、支架、图像采集系统、图像处理系统、上位机和双喷头系统。然而该细胞种植平台基于的支架材料仍然主要是水凝胶，其存在精细结构不可控以及支架的力学性能不强的缺点。

27、专利文献cn 108653815 b公开了一种三维卷曲结构，其采用先进行二维细胞图案化，然后进行自卷曲的方法构建人工血管。然而该结构无法很好完成细胞的三维种植与构建，当支架为致密结构时，种植的细胞难以渗透致密的支架，导致最终形成的管状组织的单层厚度无法达到应有的厚度；当支架材料为疏松结构时，细胞会在早期形成非必要的、层与层之间的过度迁移，从而造成多种细胞的混合，导致无法精准控制细胞在三维支架材料中的分布与增殖。更为重要的是，采用该专利方法得到的不同细胞层，层与层之间存在较为明显的空腔，同一细胞组织在进行卷曲之后，存在无法很好融合的缺陷。

28、分析现有的制备工艺在生产管状支架时，内皮细胞的间隙往往较大，这使得血管平滑肌细胞或生长因子进入内皮下间隙的几率增加，从而引起内膜增生。这些人工管状组织的制备工艺无法消除细胞层之间的空腔，导致出现渗血和动脉夹层的概率较高，血液通过内膜进入血管壁，造成管腔狭窄闭塞，并引起动脉瘤的产生。

29、根据相关文献(doi:https://doi.org/10.7461/jcen.2020.22.3.127,clinicalanalysis ofyoung adult patients with ruptured intracranial aneurysms:asingle-center study of 113consecutive patients,j cerebrovasc endovascneurosurg.2020；22(3):127-133.published online september 21,2020)报道，关于颅内动脉瘤针对年轻群体(<＝40周岁)的一项研究表明，动脉瘤的平均大小在6.6±3.7mm区间。但是在年轻群体中，小于5mm的动脉瘤即可引发病症，该研究指出年轻群体相较于中老年群体，小型动脉瘤破裂的风险更高，其中94.2％的动脉瘤破裂发生在小于10mm的动脉瘤，而在这其中更有47.6％的破裂发生在小于5mm的动脉瘤上。更值得注意的是，青年患者动脉瘤发生破裂的时间节点也相较于中老年更为靠前。当动脉瘤初步成型式，构成空腔的血管壁厚度还没有达到可以支撑其自体的机械强度，此时若经常暴露在高压以及高强度的生活环境下极易导致动脉瘤的破裂。不仅仅是动脉瘤的大小，其形状对于破裂的几率也有较大影响，在该文献中指出，长条形或者其他不规则形状的动脉瘤更易发生破裂。与此同时吸烟作为动脉瘤的一大诱因，在当下，电子烟的流行导致吸烟群体的年龄结构整体下沉，动脉瘤也随之呈早发态势。

30、然而，由于目前的支架制备工艺无法解决细胞层之间出现空腔的问题，一旦出现动脉夹层并引起动脉瘤，就只能进行手术治疗，常用的方法是颅动脉瘤夹闭术或血管内介入治疗术，这会给组织工程的应用造成严重限制，并给患者带来二次痛苦。

31、因此，如何改善现有管状组织工程支架的制备工艺，解决目前的工艺存在的细胞层之间出现空腔，容易出现渗血和导致动脉夹层的问题，以及存在引起动脉瘤的风险，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明目的就是为了解决上述技术问题，从而提供一种三维人工管状组织及其制备方法与应用。本发明的技术目的在于，解决现有制备方法获得的三维人工管状组织无法消除细胞层之间的空腔或间隙，使得制备的组织工程支架在体内容易出现渗血和动脉夹层，并容易引起动脉瘤的问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明的目的之一是提供一种三维人工管状组织的制备方法，其包括以下步骤：

4、一种三维人工管状组织的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)制备可卷曲的支架；

6、(2)在支架上种植细胞；

7、(3)将步骤(2)所得物卷曲成三维管状结构并进行体外培养，即得所述三维人工管状组织；

8、其中，所述可卷曲的支架的制备方法包括以下任一种：

9、方法一：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为两个不同的细胞种植区域，控制两个不同的细胞种植区域的宽度沿支架卷曲方向能够使得不同细胞种植区域经卷曲后各自形成至少一圈完整的管状层，且卷曲后位于外层的管状层能够包裹内层的管状层；并控制两个不同细胞种植区域中支架的厚度比由薄至厚为1:2～80；

10、方法二：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为三个不同的细胞种植区域，控制三个不同细胞种植区域的宽度沿支架卷曲方向能够使得不同细胞种植区域经卷曲后各自形成至少一圈完整的管状层，且卷曲后位于外层的管状层能够依次包裹位于内层的管状层；卷曲后的最外层包裹中间层，中间层包裹最内层，并控制三个不同细胞种植区域中支架的厚度比由薄至厚依次为1:2～80:2～3000；

11、方法三：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为四个不同的细胞种植区域，控制四个不同细胞种植区域的宽度沿支架卷曲方向能够使得不同细胞种植区域经卷曲后各自形成至少一圈完整的管状层，且卷曲后位于外层的管状层能够依次包裹位于内层的管状层；卷曲后的最外层包裹次外层，次外层包裹中间层，中间层包裹最内层，并控制四个不同细胞种植区域中支架的厚度比由薄至厚依次为1:2～80:2～700:2～3000。

12、需要说明的是，本发明中提及的多个不同细胞种植区域经卷曲后各自形成至少一圈完整的管状层，分别指的是如下情形：两个不同的细胞种植区域经卷曲后各自形成外层和内层的管状层，且外层包裹内层；三个不同的细胞种植区域经卷曲后各自形成外层、中间层和内层的管状层，且外层包裹中间层、中间层包裹内层；四个不同的细胞种植区域经卷曲后各自形成外层、次外层、中间层和内层的管状层，且外层；且外层包裹次外层、次外层包裹中间层、中间层包裹内层。

13、另外，本发明中的各层形成至少一圈完整的管状层指的是其卷曲后并不限于只形成1圈管状层，比如也可以是内层形成1.5圈或2圈或2.5圈的管状层，然后外层包裹住内层，此时外层也可以是形成大于1圈的管状层，如外层同样形成1.5圈或3圈管状层等；上述情形也同样适用于三层和四层结构，只需要满足卷曲后处于外层的细胞种植区域形成的管状层能够依次包裹住紧挨着的内层即可。

14、本发明提供的上述三维人工管状组织的制备方法，是在支架制备过程中进行三维拓扑结构的设计，通过控制不同的支架厚度比，从而能够将细胞二维图案化直接替换为细胞三维图案化，使得种植的细胞直接在三维拓扑结构中实现三维立体生长，从而在后续的卷曲过程中，每一周卷曲的支架即可为当前细胞组织提供足够的组织厚度，使得同种组织间不会存在空腔，细胞可以更好的黏附和生长。本发明方法通过在三维拓扑结构设计过程中很好控制各不同细胞种植区域的厚度比，解决了现有方法存在的无法消除细胞层之间的空腔，容易出现渗血和导致动脉夹层的问题，以及存在引起动脉瘤的风险。

15、本发明三维拓扑结构的设计，可以通过多层铺膜针扎梳理，或者静电纺丝及融喷等不同工艺进行制备，只要是按照本发明方式控制相应的厚度比，形成特定的三维拓扑结构，即能很好保证细胞的三维立体生长，从而达到消除细胞层之间的空腔，解决人工管状组织容易出现渗血和导致动脉夹层的问题，且不会引起动脉瘤。

16、本发明经卷曲形成的三维组织结构分为孔隙率、孔隙大小和纤维直径不一的两层、三层以及四层结构。其中两层结构用于神经组织，三层结构用于血管组织、尿道组织以及输精管，四层结构用于肠道组织、食道组织、气管组织以及输卵管。本发明能够很好制备出各种结构和功能各不相同的三维管状组织结构。

17、本发明对于现有技术的贡献在于：提供了一种层与层之间没有空腔的三维人工管状组织，这种人工管状组织在植入使用过程中不会出现渗血和导致动脉夹层，也不存在引起动脉瘤的风险。而现有的三维人工管状组织，均存在层与层之间的空腔问题，这种空腔容易导致出现渗血和动脉夹层，并存在引起动脉瘤的风险。

18、进一步的是，本发明的支架包括致密支架和疏松支架，所述疏松支架的孔隙率和孔径大小均大于所述致密支架。本发明通过将三维拓扑结构的支架设计成由致密支架和疏松支架组成，发现该支架结构能够很好防止细胞不同层之间的迁移，并为细胞提供充足的生长空间，使得细胞能够在支架上充分生长。通过对支架进行上述结构的设计，发现播种的细胞可以轻松侵入疏松层支架，并均匀分布在支架空隙中，其优点在于细胞不止单单停留在支架表面，而是能够使形成的组织与此疏松支架拥有相同的厚度；其次，播种的细胞由于无法穿透致密层支架，致使在卷曲过程中支架重叠部分的细胞不会在致密层降解前发生层与层间的迁移，这样就能充分保证细胞培养后形成的组织厚度，使得培养得到的组织有可以调控的厚度，且能拥有由不同功能细胞构成的多层组织。

19、例如，在构建三维人工血管时，细胞在此种支架上培养的结果是，细胞悬液可以快速渗透进入疏松层，同时细胞又不会在细胞播种的过程中通过空隙落入播种用器皿底部，悬液中的内皮细胞可以快速聚成细胞团，成团后的细胞可以贴合平整的致密层生长，且不会迁移至平滑肌层，形成的内皮组织可以更为光滑，脱细胞后的产物更有利于植入后自体血管细胞的向内皮细胞分化。

20、进一步的是，本发明所述疏松支架的厚度为20-5000μm，孔隙率为90％以上，孔径大小为20-1000μm，纤维直径为0.05-30μm；所述致密支架的厚度为1-200μm，孔隙率为59-90％，孔径大小为0.05-500μm，纤维直径为0.05-30μm。

21、进一步的是，所述疏松支架和致密支架的制备工艺包括浇筑、微注塑成型、吹筑、挤筑、压延、吹膜挤压、旋转成型、浸涂、2d打印、烫印、熔喷、水纺、针纺、静电纺丝、熔融纺丝、融喷纺丝、热粘合、化学粘合、水刺或针刺的非织造工艺中的任一种或多种。

22、进一步的是，所述疏松支架和致密支架采用的材料包括pga、pla、pcl、plc、ppdo、phbv、ha、pu、pet、pp、pe、pa、pmma、ptfe、pes、peek、ps、pp、pmma、pc、pga-tmc、pga-cl、壳聚糖或胶原蛋白中的至少一种，或是它们的共聚物材料。

23、在上述基础上，首先，本发明提供了一种由双层结构组成的人工管状组织。

24、具体的，本发明提供的双层结构的三维人工管状组织为神经组织，其支架的制备方法包括：于所述支架上划分为两个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制两个不同区域的支架厚度比由薄至厚为1:20～50。

25、进一步的是，该神经组织的支架还包含双层神经捆扎成束的结构，捆扎成束的神经由两层外皮组织包裹，从卷曲起始到卷曲末端控制捆扎成束的神经支架厚度比由薄至厚为1:12～24。

26、进一步的是，于神经支架位于卷曲起始端的区域内还设有沿轴向分布的棱状突泡，所述棱状突泡的分布密度为10-15个每毫米，长度为5-20毫米，每个棱状突泡间相互独立，由1-8微米的致密层相互分割。

27、由车祸、事故以及自然灾害等导致的外周神经创伤使得患者的感觉信号无法传送至大脑和脊髓，同时来自大脑的运动指令也无法顺利传送到目标器官。失去神经系统协调动作和感知的患者将在在日常生活中失去自理能力，对生活造成极大困扰。当前两种主流治疗方案，一为使用自神经移植，二为使用同种异体脱细胞神经进行移植。前者需要二次手术并且需要患者其他部位神经。后者需要器官或遗体捐赠以提取外周神经故无法大规模量产，并且较难进行标准化。使用本发明提及的技术构建人工神经组织支架，并通过在支架上播种从细胞库内扩增的神经细胞、神经胶质细胞以及施万细胞，并使用电刺激，引导神经轴突延管状支架延伸，生产的组织工程人工外周神经，经过脱细胞处理后可很好用于外周神经创伤的修复。本发明方法构建的人工神经组织层与层之间不会存在空腔，从而不会出现渗血和导致动脉夹层的问题，也不会存在引起动脉瘤的风险。

28、另外，本发明提供的双层结构的三维人工管状组织还包括中口径动脉血管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为两个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制两个不同区域的支架厚度比由薄至厚为1:3～75。

29、其次，本发明还提供了一种由三层结构组成的人工管状组织，具有三层结构的人工管状组织包括以下几类：

30、具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织包括中口径动脉血管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:3～58:3～60。

31、具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织还包括小口径动脉血管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2～25:3～48。

32、具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织还包括中口径静脉血管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2～38:3～70。

33、具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织包括小口径静脉血管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:5～50:7～66。

34、具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织还包括女性尿道组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:5～27:8～60。

35、具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织还包括男性尿道组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:4～28:10～66。

36、具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织还包括输精管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:4～700:16～1000。

37、另外，本发明提供了四层结构的三维人工管状组织，具有四层结构的人工管状组织包括以下几类：

38、具体的，本发明提供的四层结构的三维人工管状组织包括肠道组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2～4:2～30:3～35。

39、具体的，本发明提供的上述肠道组织包括小肠，于小肠支架位于卷曲起始端区域内还设有在轴向呈高度为4-7mm，宽度为2-3mm的突起。

40、进一步的是，所述突起包括绒毛和隐窝，其中，绒毛径向长度为1200-1600μm，轴向宽度为300-600μm；隐窝颈口直径为2-10μm，腔内直径为40-50μm。

41、具体的，本发明提供的上述肠道组织还包括大肠，于大肠支架位于卷曲起始端的支架区域内设有隐窝，所述隐窝在内层的分布密度为100个每平方毫米，隐窝径向深度为1500-2200μm，直径为400-500μm。

42、具体的，本发明提供的四层结构的三维人工管状组织包括食道组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2～100:5～600:20～1000。

43、具体的，本发明提供的四层结构的三维人工管状组织包括气管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:4～9:15～38:25～56。

44、进一步的是，在气管组织支架从卷曲起始端起第三个细胞种植区域内，还包含一部分为由机械强度高于5～10mpa的高分子材料或者软骨细胞制成。

45、进一步的是，机械强度高的区域呈环状，并且有至少一处开口。

46、具体的，本发明提供的三维人工管状组织包括输卵管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2～150:3～300:20～1000。

47、进一步的是，于输卵管组织支架靠近卷曲起始端的细胞种植区域内还设有绒毛结构，所述绒毛结构为在轴向呈高度为10-11μm，直径为0.2-0.3μm的突起。

48、本发明的目的之二是提供由如上任一方法制备得到的三维人工管状组织。

49、具体的，所述三维人工管状组织包括人工神经、人工动脉血管、人工静脉血管、人工小肠、人工大肠、人工食道、人工气管、人工尿道、人工输卵管和人工输精管。

50、进一步的是，所述人工动脉血管包括中口径动脉血管和小口径动脉血管。

51、进一步的是，所述人工静脉血管包括中口径静脉血管和小口径静脉血管。

52、进一步的是，所述人工尿道包括男性尿道和女性尿道。

53、本发明的目的之三是提供由如上任一方法制备得到三维人工管状组织的应用，其是将所述三维人工管状组织作为受损组织的替代物或体内植入物。

54、本发明的有益效果如下：

55、(1)本发明提供了一种三维人工管状组织的制备方法，该方法通过控制支架上不同细胞种植区域之间的厚度比，很好实现了对支架进行三维拓扑结构的设计，促进了细胞的三维立体生长，使得支架在卷曲过程中，每一周卷曲的支架即可为当前细胞组织提供足够的组织厚度，使得同种组织细胞层之间不会存在空腔，细胞在同一支架上可以进行更好的黏附和生长；同时，本发明通过设置疏松层和致密层支架，能够防止不同层之间的细胞发生迁移。

56、(2)本发明提供的管状组织的制备方法很好解决了现有方法存在的无法消除细胞层之间的空腔，容易出现渗血和导致动脉夹层的问题，以及存在引起动脉瘤的风险。