本发明属于植物基因工程。具体涉及一个水稻锌指转录因子家族基因的启动子p-k613克隆及其在水稻根系生长发育中的应用。
背景技术：
：：1、真核生物生长发育是转录因子结合dna顺式作用元件调控基因表达的结果。dna顺式作用元件包括启动子、增强子、沉默子、绝缘子等，其决定了基因在组织和细胞中表达的时空特异性。启动子是指转录起始位点上游的一段dna序列，通过为转录因子提供结合位点，进而招募rna聚合酶复合体调控rna的合成。根据启动子距离转录起始位点的距离，分为近端启动子区域和远端启动子区，大多数调控转录元件定位于近端启动子区。因此，克隆并深入研究启动子的结构与功能，对于理解基因在转录水平的调控机制有着较大的帮助，同时也可以为植物基因工程中调控目的基因功能性表达提供有利的工具。2、根据启动子的功能及作用方式可以分为组成型启动子、组织器官特异型启动子和诱导型启动子，以及双向启动子和人工合成启动子。早期禾本科启动子的研究主要集中玉米的ubiquitin启动子、水稻actin1、oscc1、gapdh启动子等组成型启动子(christensenand quail,1996.ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression ofselectable and/or screenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.transgenicresearch,5:213-218；zhangetal.,1991.analysis ofriceact 5′regionactivityintransgenic rice plants.plant cell,1991,3:1155；jangetal.,2002.high-level andubiquitousexpressionoftherice cytochromecgene oscc1 andits promoter activityin transgenic plants provides a useful promoter for transgenesis ofmonocots.plantphysiology,129:1473-1481)，但是研究表明，许多组成型启动子可能会引起植物的正常生理活动异常以及一些食品安全性等方面的担忧等问题，因此获取组织特异型启动子以及诱导型启动子已经成为基因工程领域研究的重点。3、水稻(oryzasatival.)是最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以其为主食。水稻根系作为植物在长期适应环境进化而来的三大营养器之一，发挥着固定、吸收水分和养分的功能。水稻育种研究结果表明，水稻各基因型的耐旱、耐涝、耐盐能力以及地上株型、育性的差异与其根系的生理优势和生长活力密切相关(吴伟明和程式华，2005.水稻根系育种的意义与前景.中国水稻科学19:174-180)。研究表明，植物激素不仅参与了植物包括根系的生长发育的调控，并且参与了植物抵御生物与非生物胁迫中发挥重要作用(zhao etal.,2015.the interaction between rice erf3 and wox11 promotes crownroot development by regulatinggene expressioninvolvedincytokininsignaling.plant cell,27:2469-2483；mai etal.,2014.genes controlling rootdevelopment in rice.rice,7:30；zhu et al.,2012.a gain-of-function mutation inosiaa11 affects lateral root development in rice.mol.plant5:154–161；kitomi etal.,2011.the auxin responsive ap2/erf transcription factor crown rootless5 isinvolved in crown root initiation in rice through the induction of osrr1,atype-a response regulator of cytokinin signaling.plant journal67:472–484；coudert et al.,2010.genetic control of root development in rice,the modelcereal.trends plant sci.15:219-226)。因此，通过分子遗传改良以提高品种本身对水分、养分的利用率和逆境的生物与非生物胁迫，将大大减少人力和物力资源的浪费，并能减少因大量化学肥料和农药流失对环境造成的污染，对确保我国的粮食安全和发展持续、高效的绿色农业具有重要意义。技术实现思路1、本发明通过基因工程的方法创建了水稻锌指转录因子家族基因k613启动子融合gus报告基因转基因植株。借助对转基因植株gus报告基因染色模式的分析，揭示k613基因启动子p-k613的表达模式，以期应用于水稻根系分子遗传改良。2、本发明在于提供了一个受激素、环境胁迫和氮素诱导表达的水稻锌指转录因子k613基因的启动子的应用。3、本发明达到上述目的的技术方案是，根据水稻公共数据库rice genomeannotation project(http://rice.uga.edu/)，以序列表seq id no 1中所获得的1-2545bp核苷酸序列为模板序列，设计适于构建表达载体的引物并在引物两端加上hind iii和bamh i的酶切位点，以水稻品种“中花11”(中国农业科学院作物科学研究所)样品为模板dna，通过pcr的方法扩增得到k613基因启动子片段。利用酶切连接的方法，将k613基因启动子片段插入到dx2181载体。进一步利用农杆菌介导的遗传转化的方法将携带p-k613片段的表达载体转入水稻愈伤组织，培育出稳定转化转基因水稻植株。4、因此，在第一方面，本发明提供了一种转录因子基因k613的启动子p-k613，所述启动子p-k613的核苷酸序列如seq id no：1所示。5、在第二方面，本发明提供了所述转录因子基因k613启动子p-k613在水稻根系诱导表达中的应用。6、进一步地，所述应用包括在生物与非生物胁迫下调控水稻植株根系生长发育的应用。7、进一步地，所述启动子p-k613被与植物抵御生物与非生物胁迫密切相关的激素、冷、聚乙二醇(peg)、硝态氮和铵态氮等诱导表达，进一步地，所述激素选自于茉莉酸甲酯(ja)、油菜素内酯(br)、细胞分裂素(6-ba)和脱落酸(aba)。8、进一步地，所述启动子p-k613在水稻根系的伸长区、中柱区域弱表达。9、在第三方面，本发明还提供了用于构建所述启动子p-k613的表达载体片段的引物，所述引物包括promk613-f和promk613-r引物对，所述promk613-f的核苷酸序列如seqid no：2所示，所述promk613-r的核苷酸序列如seq id no：3所示。10、与现有技术相比，本发明的优点如下：11、本发明通过克隆一个水稻锌指转录因子基因k613的启动子p-k613，其在水稻根系的伸长区、中柱区域弱表达。茉莉酸甲酯(ja)、油菜素内酯(br)、细胞分裂素(6-ba)和脱落酸(aba)与植物抵御生物与非生物胁迫密切相关，这些激素均能够强烈诱导p-k613表达。此外，peg模拟干旱胁迫、冷环境(4℃)、硝态氮和铵态氮也能显著诱导p-k613表达。这些说明，p-k613基因启动子是一个诱导型启动子，能够在水稻根系中受多种激素和环境诱导调控。将该启动子应用于基因工程领域，可以实现对目的基因表达的时空和组织特异性进行精准调控，同时该启动子也是在植物分子遗传改良过程中启动子改造和设计的重要资源。当前第1页12当前第1页12