突变蛋白和羟基酪醇糖苷化衍生物的合成方法

本发明属于生物工程，涉及糖基转移酶突变蛋白smrrugt33和羟基酪醇糖苷化衍生物的合成方法。

背景技术：

1、羟基酪醇是一种天然的具有脂溶性、水溶性以及生物活性的多酚类化合物，它主要是以酯化物橄榄苦苷的形式存在于橄榄的各个部位，橄榄苦苷经过水解后可得到游离的羟基酪醇。羟基酪醇基于多羟基结构，在抗氧化，预防肿瘤等多种领域具有很大的应用前景，例如癌症化学预防、抗动脉粥样硬化、抑制dna氧化损伤、保护皮肤光损伤以及抗炎等活性，近年来深受生物和医学界的重视。

2、糖苷类化合物广泛存在于各种植物体中，分布于植物的根、茎、叶、花和果实中。糖苷的化学结构种类很多，主要有含硫苷、氰醇苷、酚苷类、黄酮苷等。糖基化能够改变小分子化合物的活性、稳定性和溶解性。许多糖苷化合物具有多种生物活性，具有重要的药用价值。例如红景天苷，它存在于植物红景天中，具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基等多种生物活性，在临床上得到广泛应用；羟基红景天苷属于羟基酪醇的葡萄糖苷化物，具有良好的神经保护作用，且对人乳腺癌mcf-7细胞具有抗增殖和凋亡作用；羟基酪醇β-d-吡喃木糖苷也具有良好的神经保护功能，能够有效降低细胞内ros水平。研究羟基酪醇可通过发展热门药物分子的下游产物，能够拓宽该药物一系列的衍生物库，有助于在药物使用和药品研发方面提供新的思路。

3、目前获取糖苷化合物主要从植物中提取或者通过化学合成。但是可利用的植物资源逐渐减少，且植物体中糖苷化合物含量较低，从植物中提取的糖苷化合物成本高，工作量大，且产量远不能满足于人们的需要。化学合成法步骤繁琐，催化剂昂贵，收率低，环境污染严重，而且往往残留少量或痕量的其它有毒化学品，具有不安全性。因此急需寻找新的方法来生产糖苷化合物。

4、2006年，mao等在微生物中通过生物转化的方式进行糖基化反应，但是糖基化菌株产量及产率都普遍较低(mao z,shin hd,chen rr.2006.engineering the e.coli udp-glucose synthesis pathway for oligosaccharide synthesis.biotechnol prog 22(2):369–374.)。2015年，frederik de bruyn等人通过在重组大肠杆菌中引入蔗糖代谢途径，并在糖基转移酶uvgt2作用下，成功获得没食子酸糖基化产物没食子酸吡喃葡萄糖(frederik de bruyn,brecht de paepe,jo maertens,joeri beaupreze.development ofan in vivo glucosylation platform by coupling production to growth:productionof phenolic glucosides by a glycosyltransferase of vitisvinifera.biotechnology and bioengineering 112:1594-1603.)。为糖苷化过程提供了一种新思路。

5、相较于植物提取法和化学合成法，生物合成技术用于药物分子的制备越来越受到关注。生物合成羟基酪醇糖苷化衍生物是利用细菌、真菌等微生物，以葡萄糖或者生物质水解液为碳源，经微生物发酵生产的方法。相较于化学合成的方法，生物合成的最大优势是原料便宜、易得，同时满足环境友好，符合绿色制造的理念。

6、目前关于羟基酪醇糖苷化衍生物的专利报道极少。cn201610158902.7公开了一种表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌的构建方法和应用。但上述重组大肠杆菌的催化区域特性低，糖基化酶作用位点为羟基酪醇的3位和4位酚羟基，导致形成两种相似的糖苷化产物，分离困难，且作用在酚羟基，使多酚结构被破坏，产物的药理性质减弱。cn202210023456.4公开了一种催化合成羟基红景天苷的糖基转移酶及其编码基因和应用，其使用体外酶催化的方法，原料为昂贵的羟基酪醇、酶催化剂，其经济效益不高，难以大规模生产。上述报道的糖苷化产物均为葡萄糖苷，目前还没有利用l-酪氨酸等廉价底物生产羟基酪醇多种糖苷化衍生物的相关报道，因此，创建利用廉价底物如l-酪氨酸生产羟基酪醇多种糖苷化衍生物的方法具有重要的科研价值及社会效益。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种糖基转移酶突变蛋白smrrugt33，以及编码糖基转移酶突变蛋白smrrugt33的编码基因，进一步利用带有突变体糖基转移酶smrrugt33基因的重组酵母菌，以l-酪氨酸为底物，特异性催化羟基酪醇的醇羟基糖基化生产多种羟基酪醇糖苷化衍生物。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、一种糖基转移酶突变蛋白smrrugt33，氨基酸序列如序列表seq id no.4所示。

4、2、编码糖基转移酶突变蛋白smrrugt33的编码基因。

5、进一步，所述的编码基因，其核苷酸序列如序列表seq id no.2所示。

6、3、糖基转移酶突变蛋白smrrugt33在合成羟基酪醇糖苷化衍生物中的应用，或者

7、编码糖基转移酶突变蛋白smrrugt33的编码基因在合成羟基酪醇糖苷化衍生物中的应用。

8、4、含有糖基转移酶突变蛋白smrrugt33的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒或重组病毒。

9、进一步，所述重组载体为将糖基转移酶突变蛋白smrrugt33的编码基因构建到p426tef的重组载体。

10、5、还提供一种羟基酪醇糖苷化衍生物的合成方法，所述合成方法的具体步骤如下：

11、a.将bvtyh和dhpaas的编码基因依次构建到空载体1上，得到重组载体1；

12、b.将糖基转移酶突变蛋白smrrugt33的编码基因构建到空载体2上，得到重组载体2；

13、c.再将上述步骤中的重组载体1和重组载体2转化到酿酒酵母中，得到可表达smrrugt33的重组菌株；

14、d.步骤c的重组菌株接种至sd-his-ura培养基中，待od600达1.8-2.0时，补加葡萄糖和底物l-酪氨酸，再加入糖供体，进行发酵；发酵完毕，收集上清即可。

15、进一步所述的羟基酪醇糖苷化衍生物的合成方法中，所述空载体1为ppic9k载体；所述空载体2为p426tef载体。

16、进一步，步骤a中，扩增bvtyh基因的引物序列：(划线处为酶切位点)

17、bvtyh-f：5′-cgggatcccgatggacaacacgacgttagca-3′；seq id no.7；

18、bvtyh-r：5′-ccaagcttggttacttccttgggaccgggat-3′；seq id no.8。

19、扩增dhpaas基因的引物序列：

20、dhpaas-f：5′-gctctagagcatggatatcgaacaatttaggaa-3′；seq id no.9；

21、dhpaas-r：5′-ccctcgagggtattcagtgatagttccgttga-3′；seq id no.10。

22、进一步，步骤b中，扩增smrrugt33基因的引物序列：

23、ugt-f：5′-cggatccgatgagcttaattgaaaaaccactcacggc-3′；seq id no.11；

24、ugt-r：5′-caagcttgctaacggatatgttttgtttttgagagcagg-3′；seq id no.12。

25、进一步所述的羟基酪醇糖苷化衍生物的合成方法中，所述糖供体选自udp-葡萄糖、udp-木糖、udp-半乳糖、udp-鼠李糖、udp-果糖、udp-甘露糖中的任意一种。

26、进一步所述的羟基酪醇糖苷化衍生物的合成方法中，所述酿酒酵母为酿酒酵母by4743。

27、本发明的有益效果在于：本发明提供一种糖基转移酶突变蛋白smrrugt33，与rrugt33的氨基酸序列相比，突变位点为第465位由lys(赖氨酸)突变为asn(天冬酰胺)；所提供的编码糖基转移酶突变蛋白smrrugt33的编码基因如seq id no.2所示，将其构建到酿酒酵母细胞株中，可表达突变蛋白smrrugt33，经过生物发酵工艺，在发酵液中添加不同类型的单糖，就可以在发酵过程中转移不同类型的单糖至羟基酪醇上，得到多种羟基酪醇糖苷化衍生物。本发明的突变蛋白smrrugt33催化的特异性强且催化效率高，采用简单的生物合成手段，可实现高效绿色的糖苷类化合物的生产。并且本发明的突变蛋白smrrugt33的糖供体杂泛性高，催化多种糖供体生成糖苷化合物，可用于大规模生产多种糖苷类化合物。而且在同等条件下，大大提高了催化效率，葡萄糖的转化比原来的增加了164％。

28、本发明还提供通过载有bvtyh基因和dhpaas基因的重组质粒，再将其和载有smrrugt33的重组质粒转化至酿酒酵母中得到重组细胞株，可直接将价格廉价的l-酪氨酸底物生产中间体羟基酪醇，再转移不同类型的单糖得到各种羟基酪醇糖苷化衍生物，转化效率高，对于产业化生产来说经济快捷，可规模化生产。