一种高性能复合探针的设计及其应用检测方法

本发明涉及分析检测领域，具体涉及一种高性能复合探针的设计及其应用检测方法。

背景技术：

1、病毒性传染疾病是全球范围内的公共卫生问题，应急处理新型冠状病毒感染等具有严重的破坏性、不可预知性、群体性和突发性的突发公共卫生事件是目前医护人员工作的重点之一，而其中快速准确、高通量检测是切断病毒传播、控制病毒流行的重要手段。目前常规的病毒核酸检测方法限于基因测序和pcr。基因测序因为检测成本高昂，检测时间长，需要昂贵的相关检测设备和熟练操作人员等问题无法满足现场快速检测病毒核酸的需要。pcr检测目前被广泛应用于传染病病毒检测，但是检测时间仍旧满足不了现场快速检测的需要(＞4小时)。其他部分核酸检测技术如x-射线衍射分析、核磁共振、圆二色谱、紫外-可见光谱等因为检测灵敏度、苛刻的制样要求、仅能提供有限信息等原因仍旧停留在基础研究。

2、基于分析物开发的核酸生物传感器是一段寡核苷酸构成的dna序列，由于具有响应快、灵敏度高、价格低廉等优点而引起了越来越多的关注。但是针对于不同目标物的生物传感器往往在后续需要设计不同的检测方法以获得对应的识别信号，而且有部分序列因为会形成二聚体、发夹结构等难以实现检测，这增加了实验设计的复杂程度，同时难以实现高通量检测。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种高性能复合探针的设计及其应用检测方法。本发明的技术方案如下：

2、本发明首先提供了一种高性能复合探针的设计方法，所述复合探针包括识别探针、标准序列以及剪切序列；所述设计方法包括以下步骤：

3、s1)根据目标核酸片段构建识别探针；所述识别探针能够与目标核酸片段特异性互补；

4、s2)构建一段固定碱基序列作为标准序列，所述标准序列如seq id no.1所示；并将所述标准序列与识别探针连接构成同一段寡核苷酸；

5、s3)根据识别探针的碱基序列构建剪切序列；所述剪切序列能够与未结合目标核酸片段的识别探针进行碱基互补配对；所述的剪切序列包括茎结构、5’端侧臂以及3’端侧臂；所述茎结构含有切刻内切酶酶切识别位点；

6、作为本发明的优选方案，所述目标核酸片段为待测病毒的核酸片段。

7、作为本发明的优选方案，所述剪切序列的tm值为50-60℃，gc％含量为40％-60％。

8、本发明还提供了一种基于所述复合探针的检测方法，包括以下步骤：

9、1)通过磁珠介导在磁珠表面修饰所述的寡核苷酸，得到磁珠-寡核苷酸混合溶液；其中，目标核酸片段为待测病毒的核酸片段；

10、2)将修饰好的磁珠-寡核苷酸混合溶液与被测样品混合孵育，孵育后进行磁分离，得到修饰磁珠；

11、3)将分离得到的修饰磁珠与剪切序列混合、定容；所述茎结构含有切刻内切酶酶切识别位点；剪切序列能够与未结合被测样品的识别探针进行碱基互补配对；

12、4)将2-5μl步骤3)定容后的溶液加入到20-25μl expar扩增液中，所述expar扩增液中含有切刻内切酶；切刻内切酶通过剪切序列茎结构中的酶切识别位点激活；切刻内切酶将识别探针与标准序列的连接点作为剪切位点发生单侧剪切，从而获得游离的标准序列的核酸片段；标准序列在所述expar扩增液中实现扩增；

13、5)将步骤4)得到的扩增产物与sers基底混合，然后用532nm激光器照射，收集产生的拉曼信号，根据收集到拉曼信号来区分待测样品是否存在待测病毒。

14、作为本发明的优选方案，所述待测病毒为诺如病毒ⅰ、诺如病毒ⅱ、星状病毒、札如病毒、轮状病毒或腺病毒。

15、作为本发明的优选方案，步骤1)中，在磁珠表面修饰所述的寡核苷酸的方法为：用100-200μl 1×te缓冲液清洗10-25μl、20mg/ml的磁珠溶液三次后，定容至80-150μl，将磁珠溶液与5-25μl、10-5mol/l的所述的寡核苷酸混合，常温孵育5-30min后1×te缓冲液清洗三次，定容体积10-20μl。

16、作为本发明的优选方案，所述步骤3)中将分离得到的修饰磁珠与剪切序列混合、定容具体为：将分离得到的修饰磁珠与剪切序列混合后升温至90℃保持1分钟，并在5-10分钟内降至室温，去掉上清液，清洗三次,定容至5-10μl；

17、作为本发明的优选方案，步骤4)中expar扩增液包含了10-6-10-8m具有固定碱基序列的扩增模板、100-400μm dntp、4-6u切刻内切酶、0.4-1.0u聚合酶、扩增缓冲液(1xnebuffer)；所述扩增模板如seq id no.2所示序列，恒温扩增温度为50-60℃，时间为6-7min。

18、作为本发明的优选方案，步骤5)中的sers基底由尺寸为20-200纳米，间距5nm以下的聚集状态的纳米金或银组成。

19、作为本发明的优选方案，步骤5)中定性分析时以样品出信号时间为检测时间，样品拉曼信号强度＞1653.59counts,置信区间为3σ,即不存在儿童急性腹泻病毒，样品阴性；相反，检测到样品阳性。

20、与现有方法相比，本发明具有以下有益效果：

21、本发明方法仅需要改变复合探针序列就能够通过识别不同检测目标，识别探针同时兼具有最佳的灵敏度和特异性，能从复杂样品中精准识别待测物，另外所包含的固定序列作为标准序列，用于后续扩增、检测过程，实现对多种目标物高通量检测。

22、本发明方法中具有单碱基错配识别能力的定位探针剪切未结合的识别探针，能够准确剪切下识别探针的固定序列。标准化的固定序列经过等温指数扩增后，能够指数倍的放大信号。

23、本发明方法只需要相应调整寡核苷酸互补的序列，以及调整定位探针两侧识别序列就能够对对应病毒完成识别，仅需要一套扩增模板就能够实现信号放大。整个检测时间小于半小时(21min)就能对10-11mol/l病毒核酸片段完成检测。

技术特征：

1.一种高性能复合探针的设计方法，其特征在于，所述复合探针包括识别探针、标准序列以及剪切序列；所述设计方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述目标核酸片段为待测病毒的核酸片段。

3.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述剪切序列的tm值为50-60℃，gc％含量为40％-60％。

4.一种基于权利要求1所述复合探针的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述待测病毒为诺如病毒ⅰ、诺如病毒ⅱ、星状病毒、札如病毒、轮状病毒或腺病毒。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中，在磁珠表面修饰所述的寡核苷酸的方法为：用100-200μl 1×te缓冲液清洗10-25μl、20mg/ml的磁珠溶液三次后，定容至80-150μl，将磁珠溶液与5-25μl、10-5mol/l的所述的寡核苷酸混合，常温孵育5-30min后1×te缓冲液清洗三次，定容体积10-20μl。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中将分离得到的修饰磁珠与剪切序列混合、定容具体为：将分离得到的修饰磁珠与剪切序列混合后升温至90℃保持1分钟，并在5-10分钟内降至室温，去掉上清液，清洗三次,定容至5-10μl。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤4)中expar扩增液包含了10-6-10-8m具有固定碱基序列的扩增模板、100-400μm dntp、4-6u切刻内切酶、0.4-1.0u聚合酶、扩增缓冲液(1x nebuffer)；所述扩增模板如seq id no.2所示序列，恒温扩增温度为50-60℃，时间为6-7min。

9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤5)中的sers基底由尺寸为20-200纳米，间距5nm以下的聚集状态的纳米金或银组成。

10.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤5)中定性分析时以样品出信号时间为检测时间，样品拉曼信号强度＞1653.59counts,置信区间为3σ,即不存在儿童急性腹泻病毒，样品阴性；相反，检测到样品阳性。

技术总结
本发明公开了一种高性能复合探针的设计及其应用检测方法，属于分析检测领域。本发明所设计复合探针由识别探针、标准序列以及剪切序列组成。与目标核酸序列互补的长链识别探针，实现了对长链DNA中目标序列高特异性捕获。包含切刻内切酶识别序列的剪切序列，实现了可编程的对任意序列识别探针剪切；标准序列实现检测过程信号标准化，减少了检测时间。本发明在待测病毒检测中，无需样品前处理，实现了对6种病毒高灵敏高特异性检测，检测时间仅需要RT‑PCR的1/12。本发明方法在现场筛查如传染病检测领域具有良好的应用前景。

技术研发人员：周建光,毛基锴,单旭亮,陈洁,冯睿,王泽林,张典华
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14