基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字PCR检测试剂盒的制作方法

本发明涉及基因领域，特别涉及一种基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字pcr检测试剂盒。

背景技术：

1、脓毒症是由感染引起的全身炎症反应，可导致严重脓毒症和脓毒症休克。罹患这些严重病症的患者需要长期住院治疗，并且发病率和死亡率很高。全世界每年有2000至3000万例脓毒症患者，每3-4秒就有1人死于脓毒症。它由身体免疫系统针对严重感染产生的急性反应所引起。严重的脓毒症会导致器官功能障碍，如果低血压持续，身体还可能会进入致命性极高的脓毒性休克状态。脓毒症对其幸存者的长期影响包括永久性的器官损伤，以及生理和智力障碍。

2、尽管医学在不断进步，但严重脓毒症的发病率却在迅速上升。随着脓毒症的发病率上升，其治疗成本也在提高：在美国，1997年到2008年间的住院治疗费用上升了11.9％；在德国，据报道，典型案例的治疗成本在过去十年间增加了一倍多。早诊断在脓毒症治疗过程中起着决定性的作用。

3、目前针对脓毒症病原学的诊断方法包括：1.血培养，血培养结果阳性是诊断脓毒症的“金标准”，但并非所有脓毒症患者都可以获取阳性血培养结果，血培养阳性率受到采血量、采血时间、采血次数等因素的影响；2.血常规：血常规检测结果往往缺乏敏感度和特异性，因为血常规异常可能是很多其他原因造成的；3.炎性指标：临床上常用c反应蛋白和降钙素原进行脓毒症的诊断，但是这些指标也容易受到其他因素的影响。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字pcr检测试剂盒，通过对四个宿主基因的转录水平进行检测并通过打分规则计算出脓毒症感染概率，实现特异性更好的脓毒症诊断。

2、本方案选用四个宿主基因的转录水平情况实现对脓毒症的准确检测，四个宿主基因分别为zdhhc19、c9orf95、hla-dpb1、c3ar1。这四个宿主基因在宿主感染脓毒症病原体时都会发生一定的变化，zdhhc19在病毒感染的细胞中转录水平上调；通过单细胞测序和数字pcr技术筛选出的单核细胞差异基因c9orf95和c3ar1在早期脓毒症患者中高转录水平；hla-dpb1与移植的免疫调节相关。

3、另外，本方案开发的检测体系使用同一扩增体系的不同通道同时检测四个基因，也就是说，一个样本的四个基因在同一个扩增管中进行扩增，这样的好处在于可以确保加样量完全一致而不需要持家基因的归一化。且因为不同患者单核细胞的含量差异较大，单核细胞的收集量差异也较大，因此不同样本的总rna量不一样，检也较测时即使加相同体积的模板，检测值差异大，为了避免扩增时模板总量不同造成的差异，本方案选择四个宿主基因中转录水平比较适中的c3ar1检测值作为分母，每个通道的其他宿主基因的检测值作为分子进行检测值标准化处理，利用四个宿主基因的转录水平的检测值进行打分得到脓毒症感染值。

4、第一方面，本方案提供了一种宿主基因转录水平在进行脓毒症诊断时的应用，其中宿主基因zdhhc19、c9orf95、hla-dpb1、c3ar1，包括：获取宿主基因zdhhc19、c9orf95、hla-dpb1、c3ar1的转录水平，按照如下公式计算得到四基因打分：

5、四基因打分＝bz/bh+bc9/bh+bc3/bh；

6、其中bz为zdhhc19的转录水平，bh为hla-dpb1的转录水平，bc9是c9orf95的转录水平，bc3是c3ar1的转录水平，若四基因打分大于设定阈值则判断患有脓毒症。

7、在一些实施例中，若四基因打分大于2.18的话，判断感染脓毒症的概率大。

8、在一些实施例中，通过数字pcr方法进行四个宿主基因转录水平的检测。数字pcr的技术原理是通过分区扩增后检测所有反应单元的荧光信号，利用数字模型统计分析直接计算出目标靶分子的浓度或者拷贝数，无需对照标准样本和标准曲线，不依赖于ct值就可以实现决定定量分析。

9、在一些实施例中，在同一扩增体系的不同通道内检测四个宿主基因，获取对应通道的检测值作为宿主基因的转录水平。

10、在一些实施中，将特异性扩增宿主基因zdhhc19、c9orf95、hla-dpb1、c3ar1以及外源内参的引物探针混合得到引物探针混合液，并混合所述引物探针混合液制备ddpcr反应体系，将待测血液样本提取的rna和ddpcr反应体系混合后在设定的扩增程序下进行扩增检测得到宿主基因转录水平的检测。

11、在一些实施例中，特异性扩增宿主基因zdhhc19的引物序列如seq id no:1和seqid no:2所示，探针序列如seq id no:3所示，对应的标记序列如seq id n0:17所示。在一些实施例中，特异性检测宿主基因zdhhc19的探针序列的修饰荧光基团为fam和mgb。

12、特异性扩增宿主基因c9orf95的引物序列如seq id no:4和seq id no:5所示，探针序列如seq id no:6所示，对应的标记序列如seq id n0:18所示。

13、在一些实施例中，特异性检测宿主基因c9orf95的探针序列的修饰荧光基团为rox和mgb。

14、特异性扩增宿主基因hla-dpb1的引物序列如seq id no:7和seq id no:8所示，探针序列如seq id no:9所示，对应的标记序列如seq id n0:19所示。在一些实施例中，特异性检测宿主基因hla-dpb1的探针序列的修饰荧光基团为vix和mgb。

15、特异性检测宿主基因c3ar1的引物序列如seq id no:10和seq id no:11所示，探针序列如seq id no:12所示，对应的标记序列如seq id n0:20所示。在一些实施例中，特异性检测宿主基因c3ar1的探针序列的修饰荧光基因为cy5和mgb。

16、本方案还随机生成了如seq id no:13-14的随机引物和seq id no:15的探针作为外源内参，对应的标记序列如seq id n0:16所示。

17、具体的序列如下表一所示：

18、

19、

20、

21、第二方面，本方案提供了一种基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字pcr检测试剂盒，包括：

22、特异性扩增宿主基因zdhhc19的引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示，探针序列如seq id no:3所示；

23、特异性扩增宿主基因c9orf95的引物序列如seq id no:4和seq id no:5所示，探针序列如seq id no:6所示；

24、特异性扩增宿主基因hla-dpb1的引物序列如seq id no:7和seq id no:8所示，探针序列如seq id no:9所示；

25、特异性检测宿主基因c3ar1的引物序列如seq id no:10和seq id no:11所示，探针序列如seq id no:12所示。

26、在一些实施例中，数字pcr检测试剂盒还包括如seq id no:13-14的随机引物和seq id no:15的探针作为外源内参。

27、在一些实施例中，数字pcr检测试剂盒还包括：水、ddpcr mix，序列如seq id n0:16所示的标记序列。

28、在一些实施例中，该数字pcr检测试剂盒用于数字pcr检测，在同一扩增管的不同通道内进行检测，获取不同通道的检测值作为对应宿主基因的转录水平，基于按照如下公式计算得到四基因打分：

29、四基因打分＝(bz/bh+bc9/bh+bc3/bh)/bc3；

30、其中bz为zdhhc19的转录水平，bh为hla-dpb1的转录水平，bc9是c9orf95的转录水平，bc3是c3ar1的转录水平。

31、在一些实施例中，扩增程序为：95℃5min；【95℃15s，60℃30s】*40。

32、在一些实施例中，针对待测患者的血液样本进行检测。

33、第三方面，本方案提供了一种基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字pcr检测试剂盒的应用，用于非诊断目的的脓毒症诊断。

34、相较于现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：

35、本方案利用数字pcr扩增技术在同一扩增管的不同通道内同时检测四个宿主基因的转录水平，不需要持家基因的归一化。且为了避免扩增时模板总量不同而带来的差异，本方案选用四个宿主基因中转录水平适中的c3ar1基因的检测值作为分母对其他通道的基因检测值进行标准化处理，利用四个宿主基因转录水平的变化关系计算得到四基因打分，通过四基因打分进行脓毒症的判断，具有特异性更高结果更准确的效果。另外，本方案设计了针对四个宿主基因的引物探针序列，可更为准确地检测到对应的基因转录水平。