sgRNA、用于检测病毒的组合物、试剂盒和方法与流程

本申请属于生物检测，具体地，涉及一种sgrna、用于检测病毒的组合物、试剂盒和方法。

背景技术：

1、sherlock技术利用了cas13a的反式切割活性，通过crrna可以准确识别单链rna目标序列，进而激活cas13a，启动对偶联有报告探针的非靶向单链rna的切割，产生荧光，该技术需要对扩增产物进行体外转录。检测过程为：sherlock先在61℃通过rt-lamp等温扩增实现模板的大量扩增，然后再把rt-lamp的扩增产物加入到crispr/cas反应体系中在37℃条件下进行转录和crispr/cas切割反应，检测时间不低于2h。

2、holmes利用了lbcas12a的反式切割活性，通过crrna识别dsdna目标序列，进而激活lbcas12a的反式切割活性，启动对偶联有报告探针的非靶向ssdna的切割。检测过程为：通过pcr方法扩增富集目的基因，然后把pcr扩增产物加入到crispr/cas切割体系中在37℃条件下进行反应，检测时间不低于1h。

3、detectr则是利用了cas12a的反式切割活性，基本原理与holmes相同。不同点在于检测过程首先通过rpa等温扩增的方法扩增富集目的基因，然后把rpa扩增产物加入到crispr/cas切割体系进行反应。

4、而cdetection技术则利用了cas12b蛋白的对单链dna的反式切割活性，其识别的也是双链dna，此外，该技术通过引入tgrna，可以实现单碱基的区分。

5、公开资料显示，sherlock方法检测rna样本的检测限为1×104-1×105拷贝/ml，detectr方法检测的rna样本的检测限为1×104拷贝/ml，这两种检测方法的检测时间在1小时左右。

6、sherlock、holmes、detectr等基于cripspr的检测技术检测灵敏度都为am级别，为保证这些技术的灵敏度，都是首先进行目的基因的扩增与富集，然后把扩增产物加入到cripspr体系中进行检测，整个过程都需要2步才能完成。中间需要开盖转管的过程，存在较大交叉污染的风险。并且两步反应的温度条件均不一致，需要多个温度梯度才能实现，因此需要精确控温的仪器设备。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本申请提供一种sgrna、用于检测病毒的组合物、试剂盒和方法。

2、具体来说，本申请涉及如下方面：

3、1.一种sgrna，其特征在于，所述sgrna的长度为97-105nt。

4、2.根据项1所述的sgrna，其特征在于，所述sgrna包括骨架部分和用于识别待检测样本的靶序列的识别部分，其中所述骨架部分的的长度为77-88nt。

5、3.根据项1所述的sgrna，其特征在于，所述sgrna包括骨架部分和用于识别待检测样本的靶序列的识别部分，其中所述骨架部分的序列如seq id no:1或seq id no:2所示。

6、4.根据项2或3所述的sgrna，其特征在于，所述识别部分的序列选自seq id nos:3-6中任意一种。

7、5.一种检测病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括：

8、项1-4中任一项所述的sgrna；

9、cas12b蛋白；

10、荧光探针，以及

11、引物。

12、6.根据项5所述的组合物，其特征在于，在所述组合物中，所述sgrna的浓度为2～320ng/μl或2～80ng/μl，所述cas12b蛋白的浓度为40～800ng/μl或40～200ng/μl，所述荧光探针的浓度为200～2000nm，所述引物的浓度为300nm～1200nm。

13、7.根据项5所述的组合物，其特征在于，所述引物序列的gc含量为30-70％，长度为25-40bp。

14、8.根据项5所述的组合物，其特征在于，所述引物序列如seq id no:29和seq idno:31所示，或如seq id no:33和seq id no:35所示。

15、9.根据项5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括拥挤剂，所述拥挤剂选自peg600、peg1450、peg35000中的一种或两种以上，其中在所述组合物中，所述拥挤剂的体积浓度为5～10％。

16、10.根据项5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括trna，其中在所述组合物中，trna的浓度为10～20ng/μl。

17、11.根据项5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括mg2+和/或苏拉明钠，其中在所述组合物中，mg2+的浓度为8～25mm，苏拉明钠的浓度为3～30ng/μl。

18、12.根据项5所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括sgrna、cas12b蛋白、荧光探针、引物和mg2+，所述sgrna、cas12b蛋白、荧光探针、引物和mg2+形成冻干混合物。

19、13.根据项5所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于检测新型冠状病毒n基因，所述组合物包括sgrna、cas12b蛋白、荧光探针、引物、peg600、mg2+和苏拉明钠，其中所述sgrna的序列如seq id no:17所示，所述引物序列如seq id no:29和seq id no:31所示。

20、14.根据项5所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于检测新型冠状病毒o基因，所述组合物包括sgrna、cas12b蛋白、荧光探针、引物、trna、mg2+和苏拉明钠，其中所述sgrna的序列如seq id no:22所示，所述引物序列如seq id no:33和seq id no:35所示。

21、15.根据项5所述的组合物，其特征在于，所述病毒选自新型冠状病毒。

22、16.一种试剂盒，其包括项1-4中任一项所述的sgrna或者项5-15中任一项所述的组合物。

23、17.一种检测病毒的方法，所述方法使用项1-4中任一项所述的sgrna或者项5-15中任一项所述的组合物对待检测样本进行检测。

24、本申请的组合物设计了特定结构的sgrna和引物，提升了样本的检测灵敏度和特异性，可以将引物和探针的用量减少50％。并进一步针对新型并新型冠状病毒的n基因和o基因提供了最优的组合物，进一步提升了反应对靶点的灵敏度。此外，本申请的组合物检测病毒时可以使用单温阶检测，使得反应条件变的更简单。

技术特征：

1.一种sgrna，其特征在于，所述sgrna的长度为97-105nt。

2.根据权利要求1所述的sgrna，其特征在于，所述sgrna包括骨架部分和用于识别待检测样本的靶序列的识别部分，其中所述骨架部分的的长度为77-88nt。

3.根据权利要求1所述的sgrna，其特征在于，所述sgrna包括骨架部分和用于识别待检测样本的靶序列的识别部分，其中所述骨架部分的序列如seq id no:1或seq id no:2所示。

4.根据权利要求2或3所述的sgrna，其特征在于，所述识别部分的序列选自seq idnos:3-6中任意一种。

5.一种检测病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括：

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，在所述组合物中，所述sgrna的浓度为2～320ng/μl或2～80ng/μl，所述cas12b蛋白的浓度为40～800ng/μl或40～200ng/μl，所述荧光探针的浓度为200～2000nm，所述引物的浓度为300nm～1200nm。

7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述引物序列的gc含量为30-70％，长度为25-40bp。

8.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述引物序列如seq id no:29和seq idno:31所示，或如seq id no:33和seq id no:35所示。

9.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括拥挤剂，所述拥挤剂选自peg600、peg1450、peg35000中的一种或两种以上，其中在所述组合物中，所述拥挤剂的体积浓度为5～10％。

10.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括trna，其中在所述组合物中，trna的浓度为10～20ng/μl。

11.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括mg2+和/或苏拉明钠，其中在所述组合物中，mg2+的浓度为8～25mm，苏拉明钠的浓度为3～30ng/μl。

12.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括sgrna、cas12b蛋白、荧光探针、引物和mg2+，所述sgrna、cas12b蛋白、荧光探针、引物和mg2+形成冻干混合物。

13.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于检测新型冠状病毒n基因，所述组合物包括sgrna、cas12b蛋白、荧光探针、引物、peg600、mg2+和苏拉明钠，其中所述sgrna的序列如seq id no:17所示，所述引物序列如seq id no:29和seq id no:31所示。

14.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于检测新型冠状病毒o基因，所述组合物包括sgrna、cas12b蛋白、荧光探针、引物、trna、mg2+和苏拉明钠，其中所述sgrna的序列如seq id no:22所示，所述引物序列如seq id no:33和seq id no:35所示。

15.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述病毒选自新型冠状病毒。

16.一种试剂盒，其包括权利要求1-4中任一项所述的sgrna或者权利要求5-15中任一项所述的组合物。

17.一种检测病毒的方法，所述方法使用权利要求1-4中任一项所述的sgrna或者权利要求5-15中任一项所述的组合物对待检测样本进行检测。

技术总结
本申请提供一种sgRNA，所述sgRNA包括骨架部分和用于识别待检测样本的靶序列的识别部分，其中所述sgRNA的长度为97‑105nt。本申请还提供一种检测病毒的组合物，包括：上述的sgRNA；Cas12b蛋白；荧光探针，以及引物。本申请的组合物通过使用特定的sgRNA、引物等组分，提升了样本的检测灵敏度和特异性；并具体针对新型冠状病毒的N基因和O基因提供了最优的组合物，进一步提升了反应对靶点的灵敏度。此外，本申请的组合物检测病毒时可以使用单温阶检测，使得反应条件变的更简单。

技术研发人员：潘伟业,孙阳,程雪佳,郭义昆,樊硕,郜晓莎
受保护的技术使用者：北京迅识科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6