一种高效分离皇竹草新鲜叶面乳酸菌并快速鉴定的方法

本发明涉及生物工程，具体涉及一种高效分离皇竹草新鲜叶面乳酸菌并快速鉴定的方法。

背景技术：

1、皇竹草为多年生禾本科植物，由非洲象草和美洲狼尾草杂交选育而成，外型及生长类似甘蔗，高大粗壮可称之为草中之皇帝，且形如小斑竹，故名称皇竹草。皇竹草属四碳植物，固碳能力强，光合效率高，叶柔软、茎脆嫩，牲畜适口性好，蛋白含量高，氨基酸均衡，是一种新型高效经济作物和高产优质牧草，是各种食草性牲畜、家禽和鱼类的最佳饲料。然而，皇竹草适合在光照充足、气候温润的条件下生长，在我国大部分地区较难做到全年均衡供应，且皇竹草粗纤维含量较高，水溶性碳水化合物含量较低，直接青贮易腐烂且适口性不佳，难以获得优质的青贮饲料。

2、青贮过程是一个极其复杂的微生物共生体系，由参与其中的多种微生物的结构与多样性影响着发酵的品质与营养成分。参加青贮过程的微生物除原料上附着的微生物和引起青贮发酵的微生物外，还有能引起青贮腐败变质的微生物。研究表明，牧草表面附着乳酸菌(lab)在青贮过程起主导作用，其种类与数量是决定青贮发酵品质的关键因素之一。通常情况下，牧草表面附着的lab数量较少，在生产实践中常常通过外加lab弥补其数量的不足，进而改善其青贮发酵品质。目前皇竹草青贮饲料发酵困难、发酵质量不好，因此，在皇竹草青贮生产中，需要充分考虑外加lab，特别是将优良lab作为青贮添加剂加入皇竹草青贮中，应用于皇竹草青贮生产。有研究表明，牧草表面附着lab的发酵效率高于市售lab接种剂，所以相比于外加商业化的牧草lab接种剂，从自身叶面上分离纯化出的lab更适合于皇竹草青贮饲料的发酵，增加优质的产酸菌群含量同时还能降低杂菌的数量，相应还能提高青贮饲料的品质。

3、在现有的植物乳酸菌分离纯化中，一般都采用mrs培养基培养后通过十倍稀释法进行稀释然后平板划线分离。对于乳酸菌含量本身丰富的分离源，采用这种基础方法尚为可行，然而对于乳酸菌含量稀少的分离源，比如植物新鲜叶片，这种分离方法效果极差。另外，目前针对植物乳酸菌的鉴定还比较复杂，比如表型鉴定方法存在较大不确定性；基因型方法需要通过建立分子标记或16srdna测序，耗时耗力且成本高昂；经pcr扩增的分子鉴定方法并未形成标准化，不同文献中公布的乳酸菌基因pcr引物效果各异，有些根本无法实现特异性扩增。因此，针对现有技术中植物新鲜叶面材料中乳酸菌含量稀少且分离效率低，鉴定过程复杂等问题，急需提供一种高效分离和鉴定植物新鲜叶面(尤其皇竹草)中乳酸菌的方法，对皇竹草青贮发酵具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高效分离皇竹草新鲜叶面乳酸菌并快速鉴定的方法，为解决乳酸菌含量稀少的分离源中乳酸菌分离效率低，鉴定过程复杂等问题，通过本发明提供的方法可以高效分离和鉴定的乳酸菌，可实现乳酸菌含量少的分离源中乳酸菌的高效分离，通过本发明提供的方法分离的乳酸菌对皇竹草青贮发酵具有重要意义，具备较好的经济效益和广阔的市场前景。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种高效分离皇竹草新鲜叶面乳酸菌并快速鉴定的方法，包含如下步骤：

3、步骤一：样品收集，采集皇竹草新鲜叶片；

4、步骤二：制备菌悬浮液，将步骤一所得的叶片置于无菌生理盐水中振摇，得菌悬浮液；

5、步骤三：一重富集培养，将步骤二所得的菌悬浮液接种在mrs液体培养基中进行一重富集培养；

6、步骤四：二重特异性富集培养，将步骤三中培养所得的培养物接种于lamvab选择性培养基中进行特异性富集培养；

7、步骤五：选择性分离纯化，将步骤四中培养所得的培养物涂布于lamvab选择性培养基琼脂平板上，待平板上长出菌落后，挑取不同类型的菌落划线进行分离纯化；

8、步骤六：菌株的形态和生理鉴定，挑取划线所得的单菌落进行过氧化氢酶试验和革兰氏染色并镜检；

9、步骤七：分子生物学鉴定，选择步骤六中鉴定结果为革兰氏阳性、过氧化氢酶实验阴性的菌株，采用改良的酶法提取dna，对提取的dna进行分子生物学鉴定；

10、步骤八：菌种保藏，对步骤七中分子生物学鉴定为乳酸菌的菌株进行保藏。

11、进一步地，上述步骤三中的mrs液体培养基，其配方为每1l中含有蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、酵母浸出粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1ml、磷酸氢二钾2.0g、三水乙酸钠6.98g、柠檬酸三铵2.0g、七水硫酸镁0.2g及四水硫酸锰0.05g，调节ph为5.5～5.8；该步骤三中培养的条件为38-40℃条件下以200rpm/min振摇30-36h。

12、进一步地，上述步骤四中的lamvab选择性培养基，是将0.5g/l的盐酸半胱氨酸和0.05g/l的溴甲酚绿添加到104.4g/l的mrs液体培养基中，再将所得溶液的ph值调节至4.5～5.0，并进行灭菌，待该溶液冷却后在无菌条件下向每500ml的该溶液中加入10ml过滤灭菌的2mg/ml的万古霉素盐酸盐溶液所得；该步骤四中培养的条件为37℃厌氧培养48h。

13、进一步地，上述步骤五中的lamvab选择性培养基琼脂平板为在lamvab选择性培养基中加入15.0g/l的琼脂灭菌所得。

14、进一步地，在配制的上述lamvab选择性培养基中添加0.1g/l的放线菌酮和0.1g/l的叠氮化钠，用以抑制真菌、酵母菌或/和革兰氏阴性微生物。

15、进一步地，上述步骤五中的涂布为：将步骤四中培养所得的培养物用lamvab选择性培养基按10倍梯度稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度，梯度稀释的悬浮液各取10μl涂布于lamvab选择性培养基琼脂平板；该步骤五中培养的条件为37℃培养48h。

16、进一步地，上述的改良的酶法为：对经鉴定为革兰氏阳性、过氧化氢酶实验阴性的菌株进行培养，取培养所得的菌液加入氨苄青霉素钠盐溶液，于37℃下孵育1h，孵育后离心以收集菌体，并将菌体重新悬浮在1ml nacl-edta溶液中，再加入50μl的0.5mol/lnaoh溶液和100μl新鲜制备的50mg/ml溶菌酶溶液，将所得的混合物在37℃下孵育1h；其中，nacl-edta溶液为30mm nacl、2mm edta、ph＝8.0的溶液。

17、进一步地，上述的分子生物学鉴定包括pcr扩增鉴定、测序和比对；

18、其中，上述的pcr扩增鉴定为：采用核苷酸序列分别如seq id no：1和seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的三对特异性引物对提取的菌株dna为模板进行pcr扩增；采用核苷酸序列如seq id no：7和seq id no：8所示的通用引物对所得菌株的16s rrna基因进行pcr扩增；

19、上述的测序和比对为：对上述三对特异性引物的扩增产物进行测序，对上述通用引物的扩增产物进行测序，并将所得的16s rrna测序结果用blast软件与genebank中已登录的16s rrna基因序列进行同源比对，其中，该已登录的16s rrna基因序列的登录号为mk045823.1。

20、进一步地，上述的pcr扩增具体如下：

21、pcr扩增反应体系为25μl，包括10×pcrbuffer(mg+free)2.5μl、taq酶0.15μl、mgcl22.0μl、dntp mix 2.0μl、上下游引物各0.5μl、ddh2o16.35μl以及菌株dna模板1μl；

22、pcr扩增反应条件为94℃预变性5min；94℃30s，tm退火30s，72℃延伸，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存；

23、其中，seq id no：1和seq id no：2的tm值为60℃，延伸时间为45s；seq id no：3和seq id no：4的tm值为56℃，延伸时间为30s；seq id no：5和seq id no：6的tm值为60℃，延伸时间为30s；

24、当核苷酸序列分别如seq id no：1和seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的三对特异性引物扩增所得的产物电泳后分别得到692bp、350bp和324bp大小的条带时，表明所提取的菌株为乳酸菌。

25、进一步地，上述的菌种保藏，为乳酸菌在mrs液体培养基中震荡培养至对数期，再与40％甘油-生理盐水等比例混合，并置于-80℃保藏。

26、本发明提供的方法可为皇竹草叶面乳酸菌的分离和鉴定提供助力，采用该方法分离的皇竹草叶面乳酸菌还可用于制备菌剂，用于皇竹草青贮的发酵，具备较好的经济效益和广阔的市场前景。

27、本发明提供的一种高效分离皇竹草新鲜叶面乳酸菌并快速鉴定的方法，解决了乳酸菌分离效率低，鉴定过程复杂等问题，具有以下优点：

28、本发明对使用酶破碎细胞壁进行了改良，经改良的酶法破碎乳酸菌细胞壁释放dna具有以下优点：

29、第一是增加了edta作为螯合剂，其作用是螯合剂可以与溶液中的金属离子结合，从而抑制dna酶的活性，防止dna被酶降解，由于溶解酶的反应需要环境中有较低的离子强度，因此，edta的存在有利于溶解酶的作用；

30、第二是将酶法破碎与碱解法破碎相结合，在加入溶解酶的同时加入0.5mol/l的naoh，其原理是当溶液ph小于8.0时，溶菌酶作用将受到抑制，因此加入适量naoh提高溶液ph值将有利于溶解酶发挥作用；

31、第三是加入的氨苄青霉素钠盐溶液，青霉素在革兰氏阳性细胞壁合成过程中能够干扰n-乙酰氨基葡萄糖(nag)和n-乙酰胞壁酸(nam)部分的组装，因此可以更好地裂解革兰氏阳性细胞壁，从而释放出基因组dna。

32、本发明采用预处理富集培养方法，通过双重富集培养和选择性分离方法预处理皇竹草叶片后，结合改良的酶法更有利于富集、分离并鉴定乳酸菌，具有效率高、杂菌污染少、步骤简单、成本低等优点，在皇竹草青贮发酵中具有重要意义，具备较好的经济效益和广阔的市场前景。

33、本发明首次公布了乳酸菌分子生物学鉴定的整套流程和方法，并改良了乳酸菌细胞壁快速破碎释放dna的方法，该方法能够免去乳酸菌dna提取的步骤，并且能够较好的释放基因组dna，其dna质量完全能够满足后续作为pcr验证的模版dna的需要。特别是乳酸菌特异性引物，能够通过pcr扩增特异性鉴定乳酸菌，有利于下一步开发专用的lab接种菌剂。

34、本发明方法分离所得的乳酸菌可应用于皇竹草青贮饲料生产，弥补目前针对皇竹草等禾本科大型牧草青贮饲料制作困难、青贮质量普遍不好的难题，完全能够应用于其他类型的牧草和作物，应用范围广泛，可产生较好的经济效益，市场前景广阔。