一种羊小肠粘膜糖蛋白的提取分离纯化方法及其应用

本发明涉及一种天然来源糖蛋白的开发和应用领域，尤其涉及一种羊小肠粘膜糖蛋白的提取分离纯化方法及其用途。

背景技术：

1、糖蛋白是一种含有寡糖链的蛋白质，糖链是转移修饰后糖基化连接在蛋白质上的；糖和蛋白质之间以共价键的形式连接，广泛存在于植物、动物和微生物中，糖蛋白在动物中占比极高，许多维持生物机体正常反应如细胞间膜反应的蛋白均是一类糖蛋白，因此糖蛋白的特异性极高，近年来对糖蛋白的研究日益增多，许多研究发现它具有显著的药用功效和保健功能，如免疫调节、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤等。

2、结肠癌是指肠道内的结肠细胞增生，产生病变，出现肿瘤的癌症疾病。根据不同的病症可以将结肠癌分为两种，分别是左半结肠癌和右半结肠癌。结肠癌在我国是一种常见病，并且是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率在整个恶性肿瘤中居第3位。目前，临床上治疗结肠癌的方法有手术、放化疗等，但均存在预后性差、易产生耐药性等不足。结肠癌预防和前期轻症治疗的相关上市药物较少，因此，以抑制结肠癌细胞生长为基础的药物的研发应即刻开展。

3、肠道是生物体重要的消化器官，是消化管中最长的一段，也是功能最重要的一段。羊的肠包括小肠、大肠和直肠。来自于胃和胰腺的消化液通过导管排入小肠内，因此小肠是机体消化反应和产物吸收的主要场所。经过大量资料检索，以小肠粘膜为原料提取过的活性物质主要有肝素和肝素钠(粘多糖硫酸酯类物质)和碱性磷酸酶(非特异性磷酸单酯酶)，以

4、<肠提取>为关键词检索相关专利，得到共计45篇相关专利，从羊、牛、猪等动物的肠中提取肝素或肝素钠。其中，专利授权号cn 114790255 b，cn 101864002 a和cn102229681 a均以猪肠粘膜为原料，使用氯化钠溶液和碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和糜蛋白酶复合酶解解提取，大孔树脂富集后，乙醇多次沉淀得到抗凝活性物质肝素钠，专利授权号cn105399870 b还以猪肠粘膜为原料提取出了一种低抗凝肝素和低聚糖；专利授权号cn101914170 b以羊小肠粘膜为原料，复合酶解提取液与离子交换树脂混合后，吸附洗脱后乙醇沉淀脱盐、脱水干燥，得到较高纯度的肝素钠；专利授权号cn 106467578 a、cn103724457 a以牛肠粘膜为原料制备依诺肝素钠并加入陶瓷膜工艺去除粗品肝素钠中的杂质；此外，除了提取肝素和肝素钠，也联产提取出其他活性物质：专利授权号cn 103665192a以猪小肠为原料，实现提取肝素钠与蛋白粉的联产，专利授权号cn 113999330 a实现提取低盐浓度肝素钠与活性肠蛋白肽的分离联产，专利授权号cn 113817176 b实现类肝素与脱盐肠粘膜蛋白粉的联产。除此之外，专利授权号cn 104945539 b、cn 102633907 b、cn102898546 b、cn 102875697 b、cn 113999330b、cn 114276474 a、cn 103789373 b、cn111995698 a、cn 104059958 b、cn 103665192 b、cn 103539869a均以猪小肠为原料，选择多种不同类型的酶酶解后醇沉，提取出肝素和活性蛋白质、多肽、氨基酸。专利授权号cn101182495 a、cn 102839162 b、cn 110055237 a、cn 102839162a均以牛、猪等动物肠为原料提取碱性磷酸酶。此外，除了哺乳动物，海洋生物的肠道也通过酶解提取过相关活性物质，如cn 104987957 a、cn 103735782 b、cn 105325801a、cn1 05325801b、cn 103719926b，以鱼和海参肠为原料，不同酶酶解后得到具有生物活性的蛋白质。

5、综合所检索的结果，以猪、牛、羊、鱼等不同动物肠道为原料提取所得的活性物质主要有肝素和肝素钠、碱性磷酸酶和蛋白质多肽，但是，小肠粘膜糖蛋白的提取分离纯化研究尚未报道，本发明主要利用新疆畜牧业资源的优势，实现了对动物肠资源的充分合理再利用，提升了小肠的附加值，避免了该资源的极度浪费，变废为宝。本发明与其现有技术对比有三新：1.样品前处理方法新：现有文献中选取的提取样品大多为新鲜肠组织匀浆后直接加入提取液提取，而本发明采用的是羊小肠粘膜剪碎后冷冻干燥的粉末提取，首先确保肠腔内物质完全清洗清除干净，杂质不对后续提取产生影响；其次，液氮粉碎能将粘膜内有效物质全部释放，另外，粉末与提取液接触的比表面积大，蛋白可以更好地进入提取液，在提取液中舒展分散，提取率比匀浆高；2、样品提取方法新：现有文献中提取方法较为复杂，大多是加入复合酶酶解原料，不仅仅提高了提取的成本，耗时长，而且灭活酶的过程也同时对所提取的蛋白产生影响；本发明选用的是成本低、条件温和的缓冲液盐溶液，并且省去乙醇沉淀，保证了提取过程的安全性，工艺简单便捷易操作，适用于工业化大批量生产；3、提取活性对象新：糖蛋白由于糖链的存在，性质稳定，是一类具有多种生物活性生物大分子。前期研究报道的主要是提取方法较为成熟的肝素、肝素钠，少部分是具有生物活性的蛋白质或者分子量较小的多肽，性质较为活泼，环境条件改变后结构易改变，导致活性变差。本发明以小肠粘膜为原料，与现代生物制药技术相结合，实现了从羊小肠中提取抗肿瘤活性的糖蛋白，填补了以肠道为原料提取分离纯化活性生物大分子糖蛋白的空白，为肠提取物的医药和生物利用提供了有力的支撑和依据。

技术实现思路

1、本发明目的在于，提供一种羊小肠粘膜糖蛋白的提取分离纯化方法及其应用，该方法首先刮取新鲜羊小肠粘膜，冷冻干燥，研钵研磨得羊小肠粘膜粉末；将羊小肠粘膜粉末用磷酸盐缓冲液搅拌提取，过滤，合并滤液，冷冻干燥得羊小肠粘膜粗提物；将粗提物通过阴离子交换柱层析，凝胶柱层析和hplc分离纯化得到高纯度的羊小肠粘膜糖蛋白，通过本发明所述方法获得的羊小肠粘膜粗糖蛋白的得率为29.27±1.36％；通过阴离子交换柱层析，凝胶柱层析和hplc分离纯化的糖蛋白得率为0.97±0.34％，蛋白含量为68.72±1.12％、总糖含量为9.85±3.1％，糖醛酸含量为2.86±0.44％，纯度可达到99.36％。本方法制备工艺简单，所用试剂均为常见试剂容易购入且无毒，相较于传统提取方法，大大降低了提取成本，提高了安全性，所获得的糖蛋白具有提取率高，性质稳定，纯度高的优点，提取工艺耗时短，成本低，重复性高，适合规模化工业生产。所述方法获得的羊小肠粘膜糖蛋白，经体外抗肿瘤活性实验证实：具有优良的抑制结肠癌细胞生长的作用。

2、本发明所述的一种羊小肠粘膜糖蛋白的提取分离纯化方法，按下列步骤进行：

3、羊小肠粘膜糖蛋白的提取：

4、a、取新鲜羊小肠，用自来水清洗肠腔内容物，剥除脂肪和结缔组织，于小肠中间划开，刮取其粘膜，在温度-80℃，压力25mpa下冷冻干燥48小时得到冻干粉，将冻干粉用研钵研磨得到羊小肠粘膜粉末；

5、b、在温度4℃-37℃，以料液比1:20-1:50g/ml，将步骤a所得的羊小肠粘膜粉末加入含0.5％-3％氯化钠溶液、0.01-0.1m pbs溶液、0.5-1.0mm苯甲基磺酰氟的磷酸盐缓冲液，搅拌提取1-4h，重复3次，用纱布过滤，合并提取液；

6、c、将步骤b所得提取液在温度-80℃，压力25mpa下冷冻干燥48小时，得到羊小肠粘膜粗提物；

7、d、将步骤c所得的粗提物溶于水，并用1000da-4000da的透析袋，温度4℃脱盐48小时，冷冻干燥，得羊小肠粘膜粗糖蛋白；

8、羊小肠粘膜糖蛋白的分离纯化：

9、e、将步骤d所得的羊小肠粘膜粗糖蛋白用0.05m磷酸缓冲液溶解，吸附到用缓冲液冲洗平衡下的deae-650m阴离子交换层析柱上，流速4ml/min，依次用0.05m磷酸缓冲液配置的0-0.8m氯化钠溶液洗脱，洗脱液在280nm处检测蛋白质的吸收，通过苯酚-硫酸法在490nm处检测糖的特征吸收，选择蛋白和糖吸收互相重叠的洗脱峰为糖蛋白，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥，得到6个糖蛋白组分，分别命名为f1-f6；

10、f、采用bca法对步骤e所得的6个糖蛋白组分进行蛋白含量测定，将f5配置成浓度10-20mg/ml的样品溶液，上样hw-55f凝胶层析柱，超纯水为洗脱液洗脱，洗脱液在280nm处检测蛋白质的吸收，通过苯酚-硫酸法在490nm处检测糖的特征吸收，选择蛋白和糖吸收互相重叠的洗脱峰为糖蛋白，收集洗脱液，冷冻干燥，即得一个纯度较高的糖蛋白f5-1；

11、g、将步骤f所得糖蛋白f5-1溶于超纯水，用0.45μm滤头过滤，进样tsk gelg2000swxl 7.8×30mm，7μm高效液相色谱柱，流动相：超纯水，进样量：20μl,洗脱液流速0.8ml/min，获得较高纯度的糖蛋白，再次在相同色谱条件下进样，重复3次，收集冻干得到羊小肠粘膜糖蛋白单体化合物f5-1a。

12、所述方法获得的羊小肠粘膜糖蛋白在抑制结肠癌细胞药物中的用途。

13、所述方法获得的羊小肠粘膜糖蛋白在抑制结肠癌细胞生长的保健品中的用途。

14、所述方法获得的羊小肠粘膜糖蛋白在抑制结肠癌细胞生长的食品中的用途。

15、本发明所述的一种羊小肠粘膜糖蛋白的提取分离纯化方法及其用途，所得糖蛋白的蛋白链由丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和甘氨酸等8种氨基酸组成；糖链主要由甘露糖、葡萄糖醛酸和氨基半乳糖组成；通过体外抗肿瘤活性实验证实：提取的羊小肠粘膜糖蛋白具有抑制结肠癌细胞生长的作用，为羊小肠提取物在治疗肠道疾病和预防或治愈早期轻症结肠癌提供了科学依据。

16、本发明所述的一种羊小肠粘膜糖蛋白的提取分离纯化方法及其用途，制备工艺简单，成本低，安全性高，提取率高，重复性高，性质稳定，纯度高适合应用于医药和食品保健品领域等优点。所制备的糖蛋白具有体外抑制结肠癌细胞生长的作用，可应用于结肠癌预防或轻症的前期治疗，在医药卫生领域具有广阔的前景和深远的价值。

17、与现有技术相比，本发明所述方案的有益效果是：

18、本发明所述一种羊小肠粘膜糖蛋白的提取分离纯化方法及其用途，该方法以糖蛋白含量和活性为导向，采用磷酸盐缓冲液提取糖蛋白，与传统的盐提酸沉方法相比，不仅仅提取条件温和，提取率高，选用的试剂价格低廉，大大节省了工业化生产的试剂成本，且不用考虑试剂的腐蚀性与保存运输的不便性，最重要的是安全隐患小。离子交换柱层析deae-650m和凝胶柱层析hw-55f对羊小肠粘膜糖蛋白粗品进行分离纯化得到高纯度糖蛋白，并用hplc凝胶柱富集得到高纯度糖蛋白。本发明获得的羊小肠粘膜糖蛋白具有体外抑制结肠癌细胞生长的作用，可用作抗肿瘤相关的药物、保健品以及食品中。