用于血清半乳糖凝集素-3检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备的制作方法

本发明涉及电化学检测领域，特别涉及用于血清半乳糖凝集素-3检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备。

背景技术：

1、慢性心力衰竭(chronicheartfailure，chf)是一种以心室射血功能严重受损、外周血流分布异常为主要特征的临床综合征，其病理过程主要表现为心脏重塑和心肌纤维化，因其发病率高、预后不良导致该病死亡率较高。

2、血清gal-3是可溶性β-半乳糖苷结合凝集素，是一个相对分子质量为30kda、与g-半乳糖苷结合的蛋白，参与多种生物活性，主要已知的是其介导肿瘤生长，侵袭和转移，同时它也与年龄的增长，糖尿病肾病，纤维变性疾病如肝纤维化、肾纤维化、特发性肺纤维化和慢性胰腺炎相关。与心脏纤维化和心肌重构相关，能促进心脏成纤维细胞增殖，胶原沉积和心室功能障碍。

3、gal-3作为炎性反应的重要介质，在心肌重构和心力衰竭的病理发展过程中有重要作用，心力衰竭患者血浆gal-3水平表达越高，越易进展为心力衰竭恶化，住院率与病死率也越高。血清gal-3能促进心肌巨噬细胞的活化和迁移，加速成纤维细胞增殖以及胶原蛋白沉积，导致心脏重塑以及心肌纤维化，而心脏重塑和心肌纤维化正是影响慢性心力衰竭的重要决定性因素。血清gal-3在人体组织器官中表达的普遍性，使血清gal-3产生不受特定条件的限制。因此近年来，国内外逐渐将血清gal-3作为心力衰竭的重要诊断指标。目前，gal-3已成为欧美国家临床诊断与评估心力衰竭患者近期预后的重要指标。除此之外，gal-3还可用于各种脏器的纤维化，包括且不限于：心脏、肾脏、肝脏等。

4、到目前为止，虽然认为gal-3可用于动态或急性心衰患者的附加风险分层，但迄今为止，gal-3很少用于常规临床患者检查。用于检测人血清中血清半乳糖凝集素-3(gal-3)的方法主要有：酶联免疫法(elisa)和酶促磁微粒化学发光。gal-3分子量较小，且在各个组织器官中都有，正常人当中也有，因此其检测数据基础数据较高，现有技术及产品检测的重复性、灵敏度、特异性、稳定性和检测时间长等不能满足商业化的临床诊断的需要。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了用于血清半乳糖凝集素-3检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备。本发明提供了组合物及其在制备血清半乳糖凝集素-3(gal-3)磁微粒电化学发光检测试剂盒中的应用。本发明通过实验发现将抗体-抗原反应的高度特异性与三联吡啶钌发光的高度灵敏性结合起来，利用三联吡啶钌在dbae下产生的光子以检测产物浓度，具有灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的特点。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了组合物，包括含有生物素标记的可特异性结合gal-3的抗体、含有三联吡啶钌标记的可特异性结合gal-3的抗体和链霉亲和素超顺磁微球；

4、所述链霉亲和素超顺磁微球的粒径包括1.0～6.0μm。

5、在本发明的一些具体实施方案中，所述可特异性结合gal-3的抗体包括抗gal-3单克隆抗体。

6、在本发明的一些具体实施方案中，可特异性结合gal-3的抗体分子表面的生物素分子标记量包括2～5个。

7、在本发明的一些具体实施方案中，所述可特异性结合gal-3的抗体包括抗gal-3单克隆抗体。

8、在本发明的一些具体实施方案中，所述可特异性结合gal-3的抗体分子表面的钌分子标记量包括2～10个。

9、在本发明的一些具体实施方案中，所述链霉亲和素超顺磁微球的粒径包括3μm。

10、在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括缓冲液；

11、所述缓冲液包括：

12、20mmol/l～200mmol/l磷酸盐缓冲液，ph＝7.4；和/或

13、20mmol/l～200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液，ph＝7.4。

14、在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括第一清洗液；

15、所述第一清洗液包括2-n-二丁氨基乙醇；

16、所述第一清洗液还包括磷酸盐缓冲液。

17、在本发明的一些具体实施方案中，所述第一清洗液包括浓度90mmol/l的二丁基乙醇胺，其中含浓度300mmol/l的磷酸盐缓冲液。

18、在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括稳定剂；

19、所述稳定剂包括甘氨酸、蛋氨酸、peg20000、葡聚糖200000、普鲁兰多糖或聚乙烯比咯烷酮360中的一种或多种。

20、在本发明的一些具体实施方案中，所述稳定剂包括：

21、

22、在本发明的一些具体实施方案中，所述稳定剂与所述缓冲液的体积比为5：100。

23、在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括第二清洗液；

24、所述第二清洗液包括清洗液1、清洗液2、清洗液3和/或清洗液4；

25、所述清洗液1包括聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚和/或proclin950；

26、所述清洗液2包括氢氧化钠、氯化钠和/或次氯酸钠溶液；

27、所述清洗液3包括聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚和/或氢氧化钾；

28、所述清洗液4包括85wt％的磷酸、二氯乙酰胺、聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚、磷酸二氢钾和/或2-n-二丁氨基乙醇。

29、在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液1包括：

30、聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚     1.0g/l

31、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚        10g/l

32、proclin950                         75g/l

33、在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液2包括：

34、氢氧化钠                            120g/l

35、氯化钠                              87.75g/l

36、次氯酸钠溶液                        25g/l

37、在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液3包括：

38、聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚     1.0g/l

39、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚        10g/l

40、氢氧化钾                           9.856g/l

41、在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液4包括：

42、

43、本发明还提供了所述组合物的制备方法，所述含有生物素标记的可特异性结合gal-3的抗体的制备方法包括：取可特异性结合gal-3的抗体和生物素，混匀，反应结束后去除未标记的生物素，制得所述含有生物素标记的可特异性结合gal-3的抗体；

44、所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合gal-3的抗体的制备方法包括：取可特异性结合gal-3的抗体和三联吡啶钌，混匀，反应结束后去除未标记的三联吡啶钌，制得所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合gal-3的抗体；

45、所述链霉亲和素超顺磁微球的制备方法包括：取超顺磁微球，包被链霉亲和素，制得所述链霉亲和素超顺磁微球。

46、在本发明的一些具体实施方案中，所述含有生物素标记的可特异性结合gal-3的抗体的制备方法包括：取2.0mg的用于标记生物素gal-3抗体，使用脱盐柱pd10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(ph＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/ml，加入80μg的生物素(使用dmf溶解)，混匀反应30分钟，使用脱盐柱pd10去除未标记的生物素，制得所述含有生物素标记的可特异性结合gal-3的抗体。

47、在本发明的一些具体实施方案中，所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合gal-3的抗体的制备方法包括：取2.0mg的用于标记三联吡啶钌的gal-3抗体，使用脱盐柱pd10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(ph＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/ml，加入80μg的三联吡啶钌(使用dmf溶解)，混匀反应30分钟，使用脱盐柱pd10去除未标记的钌，制得所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合gal-3的抗体。

48、在本发明的一些具体实施方案中，所述链霉亲和素超顺磁微球为表面包裹带有链霉亲和素的超顺磁微球，所述磁微球的粒径在1.0～6.0微米，所述磁微粒包被物缓冲液为20mmol/l～200mmol/l磷酸盐缓冲液，ph＝7.4或20mmol/l～200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液，ph＝7.4。

49、本发明还提供了所述组合物在制备gal-3检测试剂盒中的应用。

50、本发明还提供了试剂盒，其包括所述组合物。

51、在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括：gal-3试剂ra、gal-3试剂rb、链霉亲和素超顺磁微球、定标品、二丁基乙醇胺清洗液、管路清洗液。

52、在本发明的一些具体实施方案中，所述gal-3试剂ra为含生物素标记的抗gal-3单克隆抗体，每个抗体分子表面的生物素分子标记量在2～5个，缓冲液为20mmol/l～200mmol/l磷酸盐缓冲液，ph＝7.4或20mmol/l～200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液，ph＝7.4。

53、在本发明的一些具体实施方案中，所述gal-3试剂rb为含三联吡啶钌标记的抗gal-3单克隆抗体，每个抗体分子表面的钌分子标记量在2～10个，缓冲液为20mmol/l～200mmol/l磷酸盐缓冲液，ph＝7.4或20mmol/l～200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液，ph＝7.4。

54、在本发明的一些具体实施方案中，所述链霉亲和素超顺磁微球为表面包裹带有链霉亲和素的超顺磁微球，所述磁微球的粒径在1.0～6.0微米，所述磁微粒包被物缓冲液为20mmol/l～200mmol/l磷酸盐缓冲液，ph＝7.4或20mmol/l～200mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液，ph＝7.4。

55、本发明还提供了以下任意项在gal-3检测中的应用：

56、(i)、所述组合物；和/或

57、(ii)、所述试剂盒。

58、本发明还提供了gal-3磁微球电化学发光检测方法，其基于如下任意项对gal-3进行检测：

59、(i)、所述组合物；和/或

60、(ii)、所述试剂盒。

61、本发明还提供了一种gal-3磁微球电化学发光试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

62、步骤1、取待测样本15μl加入反应管中，再依次加入gal-3试剂ra70μl和gal-3试剂rb70μl，于37℃孵育9min，最后加入链霉亲和素超顺磁微球40μl，于37℃孵育9min；

63、步骤2、将孵育反应完成的反应管通过吸液钢针吸入电化学流通池，并被流通池的磁铁吸附；

64、步骤3、吸液钢针吸取第二清洗液，未结合到超顺磁微球上的标记钌的抗体和样本被清洗后，流通池加电，在dbae存在的条件下三联吡啶钌发光。

65、步骤4、光电倍增管记录发光值，根据建立的标准曲线，计算样本中gal-3的浓度。

66、本发明包括但不限于取得如下有益效果：

67、本发明将抗体-抗原反应的高度特异性与三联吡啶钌发光的高度灵敏性结合起来，利用三联吡啶钌在dbae下产生的光子以检测产物浓度，具有灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的特点。