一种用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法

本发明属于胶原蛋白提取的，更具体涉及一种用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法。

背景技术：

1、胶原蛋白是广泛存在于人和动物细胞外基质的一种结构性蛋白，同时也是一种功能蛋白，它与细胞增生、分化、运动、免疫、关节润滑、伤口愈合等密切相关，广泛应用于生物医学研究、生物工程、生物医药、化妆品、化工、食品等领域。我国是较早使用纺织品的国家之一，但是皮革类纺织品有难以检测的问题。生物领域的免疫检测方法可以有效地解决这一问题，在运用特异性免疫检测皮革纺织品文物的过程中，提取牛皮胶原蛋白来制备抗体就是重中之重。

技术实现思路

1、鉴于此，为实现上述目的，本发明提供了一种用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：

2、步骤1、将预处理后的牛皮原料使用含胃蛋白酶磷酸盐缓冲溶液进行酶解，在ph＝2.0-2.5、温度为35-39℃下酶解8-10h；

3、步骤2、将酶解后所得物进行离心，取上清液，加入nacl进行盐析；盐析后离心，沉淀物即为粗胶原蛋白；将粗胶原蛋白溶于醋酸溶液中，然后在磷酸氢二钠溶液中透析，再转入蒸馏水中透析，得到牛皮胶原蛋白。

4、本发明在步骤2真空冷冻干燥后将牛皮粉碎，可以使其酶解更加完全并且可以降低酶解时间。本发明在步骤3中使用胃蛋白酶酶解，是因为胃蛋白酶对于牛皮有最好的酶解效果。酶解温度过低会降低酶解的效率，而酶解温度过高会使胶原蛋白失活，失去提取价值；酶解的时间过短会导致胃蛋白酶还没来得及破坏其细胞结构；ph过低或过高都会导致酶失活失去作用，也会导致胶原蛋白的变性与失活；加酶量与料液比会影响到酶解的速率，过低会导致速率下降，过高会导致浪费。盐析用中性盐来破坏蛋白质在溶液中稳定存在的两大因素，使蛋白质发生沉淀；透析可以除去污染物，特别是重金属和蛋白酶等对蛋白质有毒害作用的物质。

5、进一步优选的，步骤1中，所述含胃蛋白酶磷酸盐缓冲溶液的加酶量为2.0-4.0wt％。

6、进一步优选的，步骤1中，所述酶解的过程中料液质量体积比为1：20-40。

7、进一步优选的，步骤1中，所述预处理为：将牛皮清洗后，将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净，之后修剪成小块，再用磷酸盐溶液浸泡后冲洗、沥干；再进行真空冷冻干燥，粉碎，在nacl溶液中浸泡，除去盐溶性杂质，得到的固体沉淀物，即为预处理后的牛皮原料。

8、进一步优选的，除去盐溶性杂质，5000-8000r/min离心4-15min，得到固体沉淀物。

9、进一步优选的，所述磷酸盐溶液的ph为5-8；所述真空冷冻干燥的时间为12-48h；所述在nacl溶液中浸泡的过程中料液质量体积比为0.5-3:45-60，nacl溶液的质量浓度为6-18％，浸泡时间为12-14h。

10、进一步优选的，步骤2中，所述离心为8000-12000r/min离心7-20min。

11、进一步优选的，步骤2中，在上清液中加入nacl至2-5mol/l时进行盐析。

12、进一步优选的，步骤2中，所述醋酸溶液的浓度为0.3-0.9mol/l。

13、进一步优选的，步骤2中，所述磷酸氢二钠的浓度为0.01-0.1mol/l，透析时间为1-4d；所述蒸馏水中透析的时间为1-4d。

14、相比于现有技术，本发明具有以下优点：只运用单一酶在酸性条件下对其进行酶解，在不降低效率的同时，使操作流程更加方便，通过多次离心和层析等方式，去除细菌、病毒、内毒素、杂蛋白等杂质，提取保留生物活性的胶原蛋白。

技术特征：

1.一种用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤1中，所述含胃蛋白酶磷酸盐缓冲溶液的加酶量为2.0-4.0wt％。

3.如权利要求1所述的用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤1中，所述酶解的过程中料液质量体积比为1：20-40。

4.如权利要求1-3之一所述的用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤1中，所述预处理为：将牛皮清洗后，将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净，之后修剪成小块，再用磷酸盐溶液浸泡后冲洗、沥干；再进行真空冷冻干燥，粉碎，在nacl溶液中浸泡，除去盐溶性杂质，得到的固体沉淀物，即为预处理后的牛皮原料。

5.如权利要求4所述的用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液的ph为5-8；所述真空冷冻干燥的时间为12-48h；所述在nacl溶液中浸泡的过程中料液质量体积比为0.5-3:45-60，nacl溶液的质量浓度为6-18％，浸泡时间为12-14h。

6.如权利要求1所述的用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤2中，在上清液中加入nacl至2-5mol/l时进行盐析。

7.如权利要求1所述的用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤2中，所述醋酸溶液的浓度为0.3-0.9mol/l。

8.如权利要求1所述的用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤2中，所述磷酸氢二钠的浓度为0.01-0.1mol/l，透析时间为1-4d；所述蒸馏水中透析的时间为1-4d。

技术总结
本发明涉及胶原蛋白提取的技术领域，公开了一种用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：步骤1、将预处理后的牛皮原料使用含胃蛋白酶磷酸盐缓冲溶液进行酶解，在pH＝2.0‑2.5、温度为35‑39℃下酶解8‑10h；步骤2、将酶解后所得物进行离心，取上清液，加入NaCl进行盐析；盐析后离心，沉淀物即为粗胶原蛋白；将粗胶原蛋白溶于醋酸溶液中，然后在磷酸氢二钠溶液中透析，再转入蒸馏水中透析，得到牛皮胶原蛋白。本发明只运用单一酶在酸性条件下对其进行酶解，在不降低效率的同时，使操作流程更加方便，通过多次离心和层析等方式，去除细菌、病毒、内毒素、杂蛋白等杂质，提取保留生物活性的胶原蛋白。

技术研发人员：邓烨丰,王秉,刘锋,邵帅
受保护的技术使用者：浙江理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13