一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法与流程

本发明属于抗体制备，具体涉及一种从卵黄抗体igy中分离fab和fc片段的方法。

背景技术：

1、鸡卵黄抗体(igy)是一种主要存在于鸡卵黄中重要的免疫球蛋白，其蛋白结构中有两个相同的fab片段和一个fc片段，igy与哺乳动物igg相比有很多优势，可以很容易地从鸡蛋中获得(100-150mgigy/每个蛋黄)；针对哺乳动物抗原具有高亲和力；与哺乳动物igg的交叉反应较小；不激活或识别哺乳动物补体；不与类风湿因子(rf)发生反应。最近的研究表明，完整的免疫球蛋白片段对免疫反应具有显著影响。

2、fab片段由部分h链(vh+ch1)和整个lchain(vl+cl1)组成，具有抗原结合位点。由于fc片段(抗原部分)的裂解，fab片段已发展成为比完整抗体性能更好的抗菌剂，并广泛用于诊断学和生物制药研究。此外，由于其亲和结合能力，fab片段可用作纯化研究中的配体。可结晶片段(fc)通过与特定fc受体的相互作用对触发免疫防御至关重要，其包含整个重链的两个或三个结构域，ch2、ch3和ch4。

3、利用fc的糖基化可以设计出具有高治疗功效和药代动力学的抗体。许多研究人员还使用fc区域研究了igy转运到蛋黄中的机制。vermeer，norde和van表明稳定的fab和fc片段可以在完整的免疫球蛋白中充当独立的亚基，并建议可以使用分离的fab和fc片段独立研究fab和fc的功能。因此，分别收集fab和fc片段是有意义的。

4、基于目前先进的重组dna技术，可以利用哺乳动物细胞或大肠杆菌细胞进行瞬时表达，以获得合适的fab和fc片段，但是该方法非常昂贵，且有时合成的fc不起作用；另有研究表明，菠萝蛋白酶可将igy消化出fc片段和fab片段，但其主要为fc3-4(残基346-566)，其大小为53kda，而fab的值为44kda；同样的，应用胃蛋白酶时长将fc片段水解成碎片，因此缺乏简便的方法从igy中分离出有活性且完整的fab和fc。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种从卵黄抗体igy中分离fab和fc片段的方法，可显著提高蛋白片段的完整度和纯度，方法简便并保持各片段活性。

2、本发明提供了一种从卵黄抗体igy中分离fab和fc片段的方法，包括以下步骤：使用植物蛋白酶水解卵黄抗体igy，利用45％饱和度的硫酸铵溶液处理酶解液，离心收集沉淀；

3、将所述沉淀溶解后加载到deae-sepharose离子交换柱上，利用10mm tris-hcl缓冲液洗脱fab部分；再用含有0.21mnacl的10mmtris-hcl缓冲液洗脱与deaesepharose结合的fc部分。

4、优选的，所述植物蛋白酶包括木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶。

5、优选的，所述水解的温度为37℃，时间为5h。

6、优选的，所述植物蛋白酶和卵黄抗体igy的质量比为0.2:5。

7、优选的，所述水解时，将植物蛋白酶的溶液与卵黄抗体igy的溶液混合；

8、其中植物蛋白酶的溶液的制备方法包括：将木瓜蛋白酶粉末溶解在含有20mm乙二胺四乙酸二钠盐的0.1m、ph7.0pbs中，并与终浓度为100mm的半胱氨酸混合，37℃孵育3小时，得植物蛋白酶的溶液；

9、所述卵黄抗体igy的溶液以0.1m的pbs为溶剂。

10、优选的，在所述水解后，于冰上将酶解液与60mm碘乙酰胺混合，以终止反应。

11、优选的，在所述洗脱时，设置流速为1mg/ml。

12、有益效果：本发明通过使用植物蛋白酶对卵黄抗体igy进行水解消化，产生完整的有抗原结合活性的fab段和有可结晶活性的fc段。经所述水解后，即可利用盐析和离子交换层析相结合的方法进行简便有效的分离，从而得到fab和fc。经实施例验证，该方法纯化的fab和fc组分具有高纯度，fab和fc两个片段的纯度分别为88.7％和90.1％，与其他方法相比，该方法简单易行，分离出的活性片段易于使用。

技术特征：

1.一种从卵黄抗体igy中分离fab和fc片段的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用植物蛋白酶水解卵黄抗体igy，利用45％饱和度的硫酸铵溶液处理酶解液，离心收集沉淀；

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述植物蛋白酶包括木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述水解的温度为37℃，时间为5h。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述植物蛋白酶和卵黄抗体igy的质量比为0.2:5。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述水解时，将植物蛋白酶的溶液与卵黄抗体igy的溶液混合；

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述水解后，于冰上将酶解液与60mm碘乙酰胺混合，以终止反应。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在所述洗脱时，设置流速为1mg/ml。

技术总结
本发明提供了一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法，涉及抗体制备技术领域。本发明通过使用植物蛋白酶对卵黄抗体IgY进行水解消化，产生完整的有抗原结合活性的Fab段和有可结晶活性的Fc段。经所述水解后，即可利用盐析和离子交换层析相结合的方法进行简便有效的分离，从而得到Fab和Fc。经实施例验证，该方法纯化的Fab和Fc组分具有高纯度，Fab和Fc两个片段的纯度分别为88.7％和90.1％，与其他方法相比，该方法简单易行，分离出的活性片段易于使用。

技术研发人员：陈泽良,范首东,来永豪,张岩,张燚,焦洋
受保护的技术使用者：东沃同泰（凤城）生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13