一种快速提取烟草叶片基因组DNA的方法

本发明涉及一种快速提取烟草叶片基因组dna的方法。

背景技术：

1、烟草是茄科烟草属的双子叶植物，栽培历史悠久，在我国各省区均有种植，烟草是喜温植物，生育时期长，产量较高，适合大部分地区种植。目前国内外已经利用现代生物技术手段进行开展烟草育种研究工作。烟草基因组学主要涉及烟草的生产、生物胁迫和非生物胁迫等方面的重要的农艺性状以及深入研究分子机理。对于烟草的基因功能和分子机理研究，快速提取高质量的dna是研究的前提。目前，针对烟草提取dna主要是参考ctab的方法，传统的ctab法提取dna步骤：将植物组织置于2 ml离心管，加入2颗钢珠，液氮冷冻，放入研磨仪研碎；加入800 μl ctab提取缓冲液，65℃水浴1 h，期间每隔10 min颠倒混匀；12000rpm离心10 min，将上层水相转移至新的2 ml离心管，加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，12000 rpm离心10 min；小心吸取上清，转移至新的1.5 ml离心管，加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀30 min以上；12000 rpm离心10min，弃去上清，加入75%乙醇洗涤两次；在超净工作台中吹干dna，加30-50 μl ddh2o进行溶解，即为烟草dna。这种方法提取的dna浓度较高，但是用时较长，长达2小时，耗时耗力，不适合于分子标记辅助育种研究。

2、传统的提取方法工作运行效力低，成本高，浪费人力资源，同时不适合大量样本提取作业。因此开发出快速提取烟草dna的方法具有重要的意义。对此，本发明提供一种快速提取烟草叶片基因组dna的方法，对研究烟草基因的功能以及分子标记辅助育种具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了一种提取步骤简单，时间短，成本低廉，适合大量样本提取的快速提取烟草叶片基因组dna的方法，用于克服现有技术的缺陷。

2、本发明的技术方案是这样实现的：一种快速提取烟草叶片基因组dna的方法，其方法包括如下步骤：

3、1）剪取100 mg烟草叶片置于离心管中，并放入2颗玻璃珠，加入100 μl的dna抽提缓冲液，放入研磨机进行研磨后得a溶液；

4、2）在步骤1）中的a溶液中加入等体积的异丙醇，振荡混匀后得b溶液；

5、3）将步骤2）中混匀后的b溶液进行离心，移除上清；

6、4）将步骤3）中离心移除上清后的b溶液加入酒精进行清洗，再次离心后移除上清；

7、5）最后向离心管中加入ddh2o进行溶解，即得烟草dna。

8、所述的步骤1）中研磨机转速40hz，研磨时间为30秒。

9、所述的步骤3）中的离心时间为8至10分钟。

10、所述的步骤4）中的酒精浓度为70％-75％，离心时间1-2分钟。

11、所述的步骤5）中的ddh2o的用量为30至50μl。

12、所述的步骤3）中的离心转速为12000 rpm。

13、所述的步骤4）中离心转速为12000 rpm。

14、所述的步骤1）中的抽提缓冲液配制具体如下：200 mm tris-hcl（ph=7.5）、25 mmedta、250 mm nacl、0.5％ sds。

15、本发明具有如下的积极效果：本发明采用抽提缓冲液配方简单，成本低廉，提取时间短，不需转换离心管，减少操作失误，不需要液氮进行研磨，不需要高温（65℃）水浴，不使用氯仿、巯基乙醇等有机试剂，安全性高，还可以节约一半的时间成本。

16、本发明提取的烟草dna电泳条带完整，不降解，比传统ctab法精提取的dna浓度略低，但比其它粗提dna纯度高，在-20℃冰箱长时间保存，可满足大部分的pcr需求。

17、本发明提取的dna可直接用于烟草分子标记筛选，不需要稀释dna,不需要用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在2％琼脂糖凝胶电泳下即可观察差异，安全无毒，可应用于传统图位克隆、突变体检测、分子标记辅助育种等等。

技术特征：

1.一种快速提取烟草叶片基因组dna的方法，其特征在于，其方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的快速提取烟草叶片基因组dna的方法，其特征在于：所述的步骤1）中研磨机转速40hz，研磨时间为30秒。

3.根据权利要求1所述的快速提取烟草叶片基因组dna的方法，其特征在于：所述的步骤3）中的离心时间为8至10分钟。

4.根据权利要求1所述的快速提取烟草叶片基因组dna的方法，其特征在于：所述的步骤4）中的酒精浓度为70％-75％，离心时间1-2分钟。

5.根据权利要求1所述的快速提取烟草叶片基因组dna的方法，其特征在于：所述的步骤5）中的ddh2o的用量为30至50μl。

6.根据权利要求1所述的快速提取烟草叶片基因组dna的方法，其特征在于：所述的步骤3）中的离心转速为12000 rpm。

7.根据权利要求1所述的快速提取烟草叶片基因组dna的方法，其特征在于：所述的步骤4）中离心转速为12000 rpm。

8.根据权利要求1所述的快速提取烟草叶片基因组dna的方法，其特征在于：所述的步骤1）中的抽提缓冲液配制具体如下：200 mm tris-hcl（ph=7.5）、25 mm edta、250 mmnacl、0.5％ sds。

技术总结
本发明涉及一种快速提取烟草叶片基因组DNA的方法，剪取100 mg烟草叶片置于离心管中，并放入2颗玻璃珠，加入100μL的DNA抽提缓冲液，放入研磨机进行研磨后得A溶液；加入等体积的异丙醇，振荡混匀后得B溶液；混匀后的B溶液进行离心，移除上清；离心移除上清后的B溶液加入酒精进行清洗，再次离心后移除上清，最后向离心管中加入ddH2O进行溶解，即得烟草DNA；成本低廉，提取时间短，不需转换离心管，减少操作失误安全性高，还可以节约一半的时间成本。

技术研发人员：连文力,李雪君,孙计平,孙焕,侯咏,王亚乐,武东玲,平文丽
受保护的技术使用者：河南省农业科学院烟草研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13