一种由多功能干细胞构建心脏类器官的试剂盒及方法

本发明属于类器官培养领域，具体涉及一种由多功能干细胞构建心脏类器官的试剂盒及方法。

背景技术：

1、近几年类器官技术发展迅速，被视为生命科学领域最具有突破性的前沿科学技术之一，也是当下的研究热点。类器官作为一种干细胞体外培养出的3d细胞培养物，表现出显著的自我组织特性，在形态、结构、基因表达等方面与原组织具有高度同源性，打破了目前传统在体、离体模型存在的局限性，为医学和新药的开发提供了全新的研究思路。至今为止，研究人员已经成功体外培养出脑、肠道、胃、肝脏、胰腺等类器官，但是在心脏类器官领域一直进展缓慢。目前，stem cell technology等公司推出了如肝，胰腺，肾脏脑等类器官试剂盒，可以一站式解决类器官培养问题，但至今市场上可商业化应用的心脏类器官试剂盒还处于空白。

2、现有研究报道的与心脏类器官相关的培养试剂盒局限于心肌细胞的培养分化，例如公开号为cn105473708a的中国专利申请公开了一种含有甲状腺激素样化合物、直至混合物和肉毒碱化合物的水性培养基基础组合物，能够从分化为(胎儿)心肌细胞的干细胞产生成体样心肌细胞；又如公开号为cn106244526a的中国专利申请，公开了一种心肌分化试剂盒和心肌细胞的培养方法，包括心肌分化基础培养基：含糖1640培养基，以及b27、bmp4等心肌分化添加剂。然而，该试剂盒仅能用于干细胞定向分化形成单层心肌细胞，但均并不能培养得到具备3d结构的心脏类器官。单层心肌细胞相比心脏类器官缺少了3d立体结构以及类器官本身的微环境，无法用于模拟人体心脏的发育过程，难以被用于精准预测药物在人体环境中的反应。

3、因此，为填补现有技术在心脏类器官培养中的空白，提供一种成功率和可重复性高的构建心脏类器官的培养试剂盒与方法，对推进心脏治疗药物开发、安全性评价和心脏发育研究具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种由多功能干细胞构建心脏类器官的试剂盒及方法。

2、本发明提供了一种由多功能干细胞构建心脏类器官的试剂盒，包括基础诱导培养基组分，所述基础诱导培养基组分由如下体积份数的原料组成：

3、dmem培养基50份、mem维生素溶液0.05份、酵母粉超滤液0.1份、维生素e 5份、合成胆固醇0.1份、酵母提取物3份、牛血清白蛋白5份、大豆水解物5份；

4、所述维生素e是浓度为0.96g/ml的维生素e溶液。

5、进一步地，上述试剂盒包括诱导培养基a组分；所述诱导培养基a组分包括所述基础诱导培养基组分，还包括在所述基础诱导培养基组分的基础上添加的具有如下终浓度的添加物：chir99021 15～25μm，y-27632 15～25μm。

6、更进一步地，上述诱导培养基a组分由所述基础诱导培养基组分和所述添加物组成；所述添加物的终浓度为：chir99021 20μm，y-27632 20μm。

7、进一步地，上述试剂盒包括诱导培养基b组分，所述诱导培养基b组分包括所述基础诱导培养基组分，还包括在所述基础诱导培养基组分的基础上添加的具有如下终浓度的添加物：chir99021 5～15μm。

8、更进一步地，上述诱导培养基b组分由所述基础诱导培养基组分和所述添加物组成；所述添加物的终浓度为:chir99021 10μm。

9、进一步地，上述的试剂盒包括诱导培养基c组分，所述诱导培养基c组分包括所述基础诱导培养基组分，还包括在所述基础诱导培养基组分的基础上添加的具有如下终浓度的添加物：iwr-1 15～25μm、ta-01 10～20μm、ta-0210～20μm。

10、更进一步地，上述诱导培养基c组分由所述基础诱导培养基组分和所述添加物组成；所述添加物的终浓度为：iwr-1 20μm、ta-01 15μm、ta-0215μm。

11、进一步地，上述的试剂盒包括基础诱导培养基组分、诱导培养基a组分、诱导培养基b组分和诱导培养基c组分；

12、所述基础诱导培养基由如下原料组成：dmem培养基50ml、mem维生素溶液50μl、酵母粉超滤液100μl、维生素e 5ml、合成胆固醇100μl、酵母提取物3ml、牛血清白蛋白5ml、大豆水解物5ml；

13、所述诱导培养基a组分由如下原料组成：所述基础诱导培养基的原料；以及在基础诱导培养基的原料混合物的基础上添加的终浓度为20μm的chir99021和终浓度为20μm的y-27632；

14、所述诱导培养基b组分由如下原料组成：所述基础诱导培养基的原料；以及在基础诱导培养基的原料混合物的基础上添加的终浓度为10μm的chir99021；

15、所述诱导培养基c组分由如下原料组成：所述基础诱导培养基的原料；以及在前述基础诱导培养基的原料混合物的基础上添加的终浓度为20μm的iwr-1、终浓度为15μm的ta-01、终浓度为15μm的ta-02。

16、本发明还提供了一种由多功能干细胞构建心脏类器官的方法，包括使用上述的试剂盒对多功能干细胞进行诱导培养的步骤。

17、进一步地，上述的方法包括如下步骤：

18、(1)以诱导培养基a培养人体多功能干细胞1天；

19、(2)换诱导培养基b培养1天；

20、(3)换基础诱导培养基培养1天；

21、(4)换诱导培养基c培养3天，每天换新鲜的诱导培养基c；

22、(5)换基础诱导培养基继续培养，每2天换新鲜的基础诱导培养基；直至出现心脏类器官的自主搏动和/或心脏肌肉细胞基因表达。

23、本发明的有益效果：本发明提供由多功能干细胞构建心脏类器官的试剂盒，实现了在实验室中标准化可重复的批量制造心脏类器官的目的，填补了目前市场上的空白。本发明试剂盒和方法可以在15天内实现有自主搏动的心脏类器官的构建，构建的心脏类器官电生理稳定，可重复性高，适用于包括药物开发，安全性评价和研究心脏发育过程等应用。同时，本发明试剂盒也适用于单层心肌细胞的培养，为单层心肌细胞的培养提供了更多的选择。

24、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

25、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种由多功能干细胞构建心脏类器官的试剂盒，其特征在于，包括基础诱导培养基组分，所述基础诱导培养基组分由如下体积份数的原料组成：

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括诱导培养基a组分；所述诱导培养基a组分包括所述基础诱导培养基组分，还包括在所述基础诱导培养基组分的基础上添加的具有如下终浓度的添加物：chir9902115～25μm，y-27632 15～25μm。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导培养基a组分由所述基础诱导培养基组分和所述添加物组成；所述添加物的终浓度为：chir99021 20μm，y-27632 20μm。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括诱导培养基b组分，所述诱导培养基b组分包括所述基础诱导培养基组分，还包括在所述基础诱导培养基组分的基础上添加的具有如下终浓度的添加物：chir990215～15μm。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导培养基b组分由所述基础诱导培养基组分和所述添加物组成；所述添加物的终浓度为:chir99021 10μm。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括诱导培养基c组分，所述诱导培养基c组分包括所述基础诱导培养基组分，还包括在所述基础诱导培养基组分的基础上添加的具有如下终浓度的添加物：iwr-1 15～25μm、ta-01 10～20μm、ta-02 10～20μm。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述诱导培养基c组分由所述基础诱导培养基组分和所述添加物组成；所述添加物的终浓度为：iwr-1 20μm、ta-01 15μm、ta-02 15μm。

8.如权利要求1～7任一项所述的试剂盒，其特征在于，包括基础诱导培养基组分、诱导培养基a组分、诱导培养基b组分和诱导培养基c组分；

9.一种由多功能干细胞构建心脏类器官的方法，其特征在于，包括使用权利要求1～8任一项所述的试剂盒对多功能干细胞进行诱导培养的步骤。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明提供了一种由多功能干细胞构建心脏类器官的试剂盒，并且提供了使用该试剂盒构建心脏类器官的方法。本发明实现了在实验室中标准化可重复的批量制造心脏类器官的目的，可以在15天内实现有自主搏动的心脏类器官的构建，构建的心脏类器官电生理稳定，可重复性高，适用于包括药物开发，安全性评价和研究心脏发育过程等应用。同时，本发明试剂盒也适用于单层心肌细胞的培养，为单层心肌细胞的培养提供了更多的选择。

技术研发人员：钟启星,钟治晖
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14