一种基于回文序列的DNA分子量标准制备方法

本发明属于分子生物学，具体涉及一种基于回文序列的dna分子量标准制备方法。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、dna分子量标准又称dnamarker，是分子生物学电泳实验中经常使用到的一种dna片段的定性或定量参照物，由一系列不同长度的dna片段组成。在琼脂糖凝胶电泳中，通过将dna marker与dna片段一起电泳分析，可以对待测dna片段的长度和浓度做出大致估计。

3、目前常用的dna marker的制备方法为：质粒限制性酶切法和pcr法。限制性酶切法利用dna分子中存在的限制性内切酶酶切位点(天然的或人为加入的)，采用合适的内切酶对其进行消化，从而形成一组分子量各异的dna片段，用来作为dna分子量标准；该方法的主要缺陷在于内切酶的成本较高。而pcr扩增法主要利用工程菌株以投入引物和dntp进行合成，技术门槛较低，缺点在于需要根据载体序列和产生的dna片段设计多条引物，耗费时间长，生产效率较低。

4、本发明认为，目前常见的dna分子量标准中，分子量梯度通常在100～200bp，小分子量梯度(如100bp以下)的marker制备研究还较为空白，本领域研究中如crispr的sgrna筛选,shrna表达载体的筛选，基因组重复序列的拷贝数鉴定等研究领域通常需要用到分子量跨度更小的marker(小于100bp)。针对上述研究现状，发明人认为，提供一种高效、快速且成本经济的小分子量dna分析量标准制备方法具有重要的经济意义。

技术实现思路

1、发明人研究发现，在quickchange pcr反应中加入含有回文序列的引物可以通过引物碱基间的错配在质粒中获得多拷贝的扩增序列。本发明设计将其应用于dna分子量标准合成，通过优化引物设计可以实现100-1200bp范围的dna条带制备，并且上述dna条带能够形成跨度更小的一系列分子量梯度，具有速度快、成本低的优势。

2、基于上述技术效果，本发明提供一种基于回文序列的dna分子量标准的制备方法，至少包括如下步骤：

3、以靶质粒为模板，加入串联引物进行quickchange pcr扩增获得多拷贝回文序列产物，回收该多拷贝扩增产物，酶切处理后转入感受态菌中，加入检测引物进行pcr扩增并筛选得到多拷贝质粒，根据目标分子量设计制备引物对所述多拷贝质粒进行扩增，将扩增产物定量后混合即为上述dna分子量标准。

4、dna分子量标准即一系列分子量成梯度的dna条带混合物，上述制备方法利用quickchange pcr对于错配的高容忍率，并通过回文序列引发串联引物之间的互补配对，使得质粒中重复产生多拷贝回文序列产物，如1拷贝、2拷贝、3拷贝、4拷贝、5拷贝……等，扩增条带每延长一个拷贝，dna条带增加一个梯度。该方法尤其适用于小分子量的marker制备，本发明所称的“小分子量dna分子量标准”表示每一梯度的分子量跨度较小，为20～100bp，相比市面上常见的marker(分子量跨度大多在100～200bp)，本发明提供的dna分子量标准属于一种小分子量的dnamarker。

5、本发明从上述多拷贝回文序列产物筛选能够形成系列梯度分子量的阳性克隆进行扩增并提取扩增产物得到的dna条带，将上述dna条带进行定量得到该dna分子量标准。通过调整多拷贝回文序列产物的扩增位点(即制备引物的结合位点)，本发明可以较为容易的获得不同长度的dna条带，而对于1200bp以上的条带来说，20～100bp的分子量跨度可能不具有指示意义，因此，本发明提供的dna分子量标准中，所述系列梯度分子量可能至少包含五种分子量的dna条带，优选为七种及以上，优选覆盖100bp～1200bp长度范围。以下通过几种实例进行说明：

6、一种实例中，所述dna分子量标准包括700bp，780bp，860bp，940bp，1020bp的dna条带；即从上述多拷贝回文序列产物中，筛选能够扩增得到700bp，780bp，860bp，940bp，1020bp的扩增产物的阳性克隆质粒进行扩增及提取，每种条带浓度定量为300ng/ml，分子量跨度为80bp。

7、又一种实例中，所述dna分子量标准包括190bp，270bp，350bp，430bp，510bp。

8、又一种实例中，所述dna分子量标准中，包括上述190bp，270bp，350bp，430bp，510bp，700bp，780bp，860bp，940bp，1020bp的dna条带，或根据使用目的从上述序列进行选择。

9、上述制备方法中，所述靶质粒可采用本领域已知的常规质粒，包括pbr型、puc型、pbluescriptii型、pgm型、ptz型、pcl型和pet型；较为优选的方案中，所述靶质粒采用小分子量的质粒，如分子量小于5000bp的质粒，可行的具体实例如puc、pbr型、pgm型，本发明验证的一种实施方式中，采用的靶质粒为pgm-a3。

10、所述串联引物中部包括回文序列，即所述串联引物中自5’端至3’端依次为上游序列、回文序列及下游序列，并且上游引物、下游引物的序列不完全互补配对；所述串联引物的长度为45～60bp，其中回文序列的长度为15～25bp，下游序列长度大于上游序列形成缺刻。

11、上述串联引物的设计中，上下游引物不能完全互补配对使得pcr扩增后dna链产生粘端，在宿主菌中环化时产生缺刻位点，由宿主菌的连接酶连接缺刻位点，使得质粒环化，从而实现扩增产物的延长。回文序列的长度与多拷贝回文序列产物中一个拷贝的长度相关，单拷贝的长度＝回文序列+串联引物的3’末端序列+引发多拷贝形成的序列，因此回文序列控制在15-25bp范围内，而上下游序列的长度可根据靶质粒中at/gc的含量进行调整，如果串联引物结合位点的gc碱基较高，则串联引物可以较短，如45～55bp；相应的，at碱基含量较高，那么串联引物可以较长，如50～60bp。

12、本发明验证的一种实施方式中，所述靶质粒为pgm-a3，对应的串联引物(pgm-1)，序列如下：

13、上游：gacgaaacaccgggtcttcctaggaagacctgttttagagctagaaatagcaag

14、下游：ctagctctaaaacaggtcttcctaggaagacccggtgtttcgtcctttccac

15、本发明验证的又一种实施方式中，针对pgm-a3提供又一种串联引物(pgm-2)，序列如下：

16、上游：gacgaaacaccggagacgggatcccgtctctgttttagagctagaaatagcaag

17、下游：ctagctctaaaacagagacgggatcccgtctccggtgtttcgt

18、上述两种实施方式中，下划线部分为回文序列。

19、所述quickchange pcr的一种扩增的方式如下：以pgm-a3为模板，引入上述串联引物、dntp及pfu dna高保真聚合酶进行pcr扩增。

20、所述感受态菌的构建方式不限于化学方法或电转化方法，所述化学方法可行方式如胰蛋白胨-氯化镁法、氯化钙法，本领域技术人员可自行选择，对上述转化效果不具有显著影响；所述菌可采用本领域常见工程菌，如大肠杆菌。

21、在多拷贝质粒的筛选过程中，加入检测引物进行菌落pcr扩增，通过凝胶电泳筛选其中形成了多拷贝的质粒载体。所述检测引物通常采用质粒的通用引物，在上述实施方式中，所述靶质粒为pgm-a3，所述串联引物为pgm-1，所述检测引物采用pgm的通用引物m13，称为检测引物(m13)，序列如下：

22、m13上游：cgccagggttttcccagtcacgac；

23、m13下游：cacacaggaaacagctatgac。

24、筛选得到多拷贝质粒后，技术人员可根据制备marker所需要的目标分子量条带设计制备引物对多拷贝质粒进行扩增；所述制备引物可以与检测引物相同，可以是一对或多对。

25、本发明设计的一种实施方式中，所述靶质粒为pgm-a3，串联引物为pgm-1，所述检测引物为m13，所述制备引物为m13和/或以下短序列引物：

26、短序列上游:tgcttaccgtaacttgaaagt；

27、短序列下游：gaattcgctagctctcga。

28、加入制备引物进行扩增的程序如下：

29、反应条件：95～97°4～6min，95～97°18～22s，54～56°18～22s，71～73°28～32s，共34个循环，71～73°2～4min，14～16°保存；对上述扩增后的产物进行dna浓度测定，根据测定浓度对不同分子量的条带进行定量后混合，获得所述dna分子量标准。

30、上述扩增程序中，如果5个及以上拷贝的条带浓度较低，可以适当延长34个循环中71～73°的反应时间，如延长至1min。如果杂带较多，可以将34个循环中54～56°升高至57～58°。

31、以上一个或多个技术方案的有益效果是：

32、1、本发明提供的制备方法尤其适用于跨度为20-100bp的小分子量段的marker制备具有速度快、成本低的优势，扩增片段长度在100～1200bp范围内的dna分子标准。基于上述方法通过一次pcr扩增得到的阳性克隆中含有多种分子量段的dna条带，生产人员可依据市场需求进行灵活的定制，可快速满足瞬息万变的多样化市场需求。

33、2、本发明中所述串联引物采用普通的rpc合成纯化方法即可，成本较低。