一种用于富集肺癌循环肿瘤细胞的磁分离方法

本发明属于生物，具体涉及一种用于富集肺癌循环肿瘤细胞的磁分离方法。

背景技术：

1、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,ctcs)是一种从原发肿瘤中脱落进入外周血流循环中的肿瘤细胞。ctc与人体内肿瘤的产生、转移、复发直接相关，其作为一种新型的肿瘤检测标志物，提供的宝贵信息对于肿瘤的早期诊断、预后判断和治疗具有重要意义。在我国，肺癌是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近年来，我国的肺癌患者人数逐年增加且呈年轻化趋势，死亡率居高不下。肺癌的预防和早期发现已成为我国肿瘤控制的重点内容。然而，在复杂外周血液基质中肺癌循环肿瘤细胞的痕量分布给诊断带来了一定的困难。因此，迫切需要建立一种用于肺癌循环肿瘤细胞的高效分离和富集的方法。

2、许多技术已经用于ctcs的分离与富集，例如：密度梯度离心法、膜过滤法、介电分离、流式细胞术等。然而，现有方法存在操作复杂、分离效果差、稳定性不佳、破坏细胞生物特性等问题，影响检测的最终结果。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本发明的目的旨在提供一种聚-l-赖氨酸介导的叶酸修饰磁性纳米粒子快速富集分离肺癌循环肿瘤细胞的方法。叶酸作为偶联在磁性纳米粒子上的靶向分子可以从外周血液中快速、有效地分离目的肺癌循环肿瘤细胞，捕获效率高、操作简便、分离时间短。

2、本发明具体是通过如下技术方案实现的：

3、聚-l-赖氨酸介导的叶酸快速富集分离肺癌循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：

4、1)将磁性纳米粒子洗涤后重悬于无菌mes缓冲液中；

5、2)依次将edc和nhss加入至步骤1)所得的悬浮液，室温条件下孵育1h，将活化后的磁性纳米粒子再次洗涤重悬；

6、3)将聚-l-赖氨酸溶于去离子水中，然后加入至步骤2)活化后的磁性纳米粒子悬浮溶液，在室温条件下慢速旋转搅拌反应2h，对所得的反应产物进行洗涤重悬，最终得到聚-l-赖氨酸修饰的磁性纳米粒子复合物；

7、4)将fa-peg2k-nhs溶于pbs缓冲液中，将步骤3)制备得到的聚-l-赖氨酸修饰的磁性纳米粒子复合物加入本步骤制备得到的溶液中，混匀孵育3h。然后，在15,000rpm，10min条件下分离、洗涤产物，重悬后得到叶酸～聚-l-赖氨酸～磁性纳米粒子复合物。

8、5)将步骤4)所得溶液加入含循环肿瘤细胞的待测样品溶液，置于混匀仪上，以180rpm的转速37℃孵育45min，形成循环肿瘤细胞～fa-peg2k-nhs～聚-l-赖氨酸-磁性纳米粒子复合物；将离心管插入磁力架分离30min，磁力分离后，用pbs缓冲液洗涤后重悬，即得循环肿瘤细胞～fa-peg2k-nhs～聚-l-赖氨酸-磁性纳米粒子复合物。

9、进一步地，步骤1)所述磁性纳米粒子表面修饰羧基，其粒径为50nm。

10、进一步地，所述洗涤、重悬均采用无菌mes缓冲液。

11、进一步地，所述无菌mes缓冲液的浓度为10mm，ph为6.0。

12、进一步地，步骤3)所述聚-l-赖氨酸的分子量为4-5kda。

13、进一步地，步骤4)所述fa-peg2k-nhs的分子量为2k。

14、本发明选择叶酸作为肺癌肿瘤细胞表面过表达的叶酸受体的特异靶向配体，利用富含氨基的聚-l-赖氨酸与磁性纳米粒子表面的羧基相连，然后fa-peg2k-nhs通过酰胺反应与聚-l-赖氨酸修饰的磁性纳米粒子复合物相连，最终利用叶酸与肺癌肿瘤细胞表面过表达的叶酸受体特异性结合，从而达到本发明富集分离的目的。具体原理见图1。

15、进一步地，步骤1)所述磁性纳米粒子与步骤3)所述聚-l-赖氨酸的质量比为1:5。

16、进一步地，步骤2)edc和nhss的质量比为2.90:3.25

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、1.本方法适用于从复杂血液样品基质中富集分离循环肿瘤细胞，血液样品处理方法简便、快速，大大简化了样品前处理流程。

19、2.本方法选择叶酸作为肺癌肿瘤细胞表面过表达的叶酸受体的特异靶向配体，相比于抗体，具有亲和力高、成本低等优点。基于上述优点，在单次分离过程中，本发明构建的聚-l-赖氨酸介导的叶酸修饰磁性纳米粒子复合物在成本上较免疫磁分离成本大大降低，在材料保存方面较免疫磁珠保质期也更长，提高了磁分离技术的实际应用价值。

20、3.本发明合成的聚-l-赖氨酸介导的叶酸修饰磁性纳米粒子复合物是先通过edc和nhss将磁性纳米粒子表面的羧基活化，然后再利用富含氨基的聚-l-赖氨酸与磁性纳米粒子表面的羧基相连，形成聚-l-赖氨酸-磁性纳米粒子复合物后再通过酰胺反应与fa-peg2k-nhs结合；随后将其加入含有循环肿瘤细胞的血液中进行反应，得到循环肿瘤细胞～fa-peg2k-nhs～聚-l-赖氨酸-磁性纳米粒子复合物。本发明合成的叶酸修饰后的磁珠具有良好的生物相容性和较低的生理毒性，能减小对细胞的损伤，使得分选之后的细胞依然具有良好的生物活性，便于检测。

21、4.本发明采用的聚-l-赖氨酸是一种含有高密度活性氨基的生物友好型聚合物，本身具有良好的生物相容性和溶解性、柔性的分子骨架等优点。带正电荷的聚-l-赖氨酸修饰的磁性纳米粒子，其表面被改性为正电荷，粒子与粒子之间相互排斥，避免聚集，从而增加复合物的水溶性和生物相容性。

22、5.本发明采用的叶酸是一种广谱的识别循环肿瘤细胞的小分子探针，与在各种不同类型的肿瘤细胞表面过表达的叶酸受体之间具有高亲和力(kd＝～10-10m)，是用于分离血液基质中循环肿瘤细胞的一种通用的分离策略，保证了检测应用的灵活性，和细胞结合后，具有高效的分离和捕获效果。

技术特征：

1.一种用于富集肺癌循环肿瘤细胞的磁分离方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述用于富集肺癌循环肿瘤细胞的磁分离方法，其特征在于，步骤1)所述磁性纳米粒子为市售的工业化羧基磁珠(超顺磁性聚合物纳米微球)，磁核为四氧化三铁，壳层为聚苯乙烯，表面修饰有羧基官能团，其粒径为50～180nm。

3.根据权利要求1所述用于富集肺癌循环肿瘤细胞的磁分离方法，其特征在于，所述洗涤、重悬均采用无菌mes缓冲液。

4.根据权利要求1或3所述用于富集肺癌循环肿瘤细胞的磁分离方法，其特征在于，所述mes缓冲液的浓度为10mm，ph为6.0～7.0。

5.根据权利要求1所述用于富集肺癌循环肿瘤细胞的磁分离方法，其特征在于，步骤3)所述聚-l-赖氨酸分子量为4-5kda。

6.根据权利要求1所述用于富集肺癌循环肿瘤细胞的磁分离方法，其特征在于，步骤4)所述fa-peg2k-nhs的分子量为2k。

7.根据权利要求1所述用于富集肺癌循环肿瘤细胞的磁分离方法，其特征在于，步骤2)所述edc和nhss的质量比为1:1～1:3。

技术总结
本发明公开了一种用于富集肺癌循环肿瘤细胞的磁分离方法，属于生物技术领域。本发明方法包括磁性纳米粒子与聚‑L‑赖氨酸的偶联，聚‑L‑赖氨酸修饰的磁性纳米粒子复合物与叶酸的偶联，聚‑L‑赖氨酸介导的叶酸修饰的磁性纳米粒子捕获血液中的肺癌循环肿瘤细胞，在外加磁场的作用下，将捕获的肺癌循环肿瘤细胞与血液进行分离等步骤。本发明的磁珠具有良好的生物相容性和分散性，且具有较低的生理毒性，和细胞结合后，具有高效的分离和捕获效果。

技术研发人员：邹叶青,许恒毅,申阳,滕红
受保护的技术使用者：南昌大学第二附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24