一种产4-乙基愈创木酚枯草芽孢杆菌及其在酱油酿造中的应用的制作方法

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其在提高酱油中4-乙基愈创木酚含量中的应用，具体涉及一种高耐盐性枯草芽孢杆菌及其在提高酱油中4-乙基愈创木酚含量中的应用，属于微生物发酵工程。

背景技术：

1、酱油是一种传统调味品，在我国、韩国和日本广受欢迎。酱油发酵机理是一个错综复杂的生物化学反应过程，发酵过程中环境中的微生物，如芽孢菌、酵母菌和乳酸菌等，会产生许多特征性风味化合物。目前从酱油中发现的特征性风味化合物主要有：4-乙基愈创木酚（4-ethylguaiacol，4-eg）、4-乙烯基愈创木酚（4-vinylguaiacol，4-vg）、3-甲硫基丙醇、吡嗪类化合物等。其中4-eg是一种挥发性酚类化合物呈发酵香气，具有烟熏味、丁香味和辛香味的物质，属酱香型香气，其作为酱油关键风味成分，具有缓和咸味作用，香气很受消费者欢迎。4-eg风味阈值极低，0.5mg/l的浓度就能被感官识别，1~2mg/l的浓度便可明显改善酱油的风味品质。

2、酱油中的愈创木酚类物质主要来源于酱油小麦原料中的阿魏酸（fa），在酱油制曲过程中原料中的阿魏酸被酶水解释放，研究发现许多微生物可以利用阿魏酸转化成4-乙烯基愈创木酚（4-vg）再通过4-vg还原酶合成4-eg。在已发现的微生物中，多数菌株只能将阿魏酸转化为4-vg，只有少部分菌株可以利用阿魏酸合成4-eg。但在酱油酿造过程因为环境恶劣（高盐、高温、低氧），微生物生长困难，因此，自然发酵的酱油中4-eg含量是比较低的。

3、中国专利cn 112980743 a公开了一种枯草芽孢杆菌及其在提高酱油中4-乙基愈创木酚含量中的应用，包括如下步骤：(1)小麦麸皮预处理得到小麦麸皮粉末；(2)霉菌酶液的制备；(3)酶解反应制备阿魏酸粗提液；(4)微生物发酵转化阿魏酸粗提液产生含有4-乙基愈创木酚的发酵液；(5)将含有4-乙基愈创木酚的发酵液加入到酱油发酵后期的酱醪中，可提高酱油中4-乙基愈创木酚含量。

4、目前高盐稀态发酵工艺是我国酱油酿造的主要方法，其主要的工艺特征是在较高盐浓度（20% 盐浓度）下进行控温或非控温发酵2-6个月。上述能生物转化法虽然能够直接利用fa合成4-eg，但其菌株耐盐性不高，不能直接应用于酱油生产。其所生产4-eg的应用是通过分别发酵，最后将含有4-乙基愈创木酚的发酵液加入到酱油发酵后期的酱醪中，以实现高酱油中4-乙基愈创木酚含量的目的。因其菌株不耐盐，存在生产工艺步骤路线较长、生产周期长、能耗大、生产成本高、不利于规模化生产等缺陷。

5、因此，急需研究分离筛选出耐盐性高、能代谢合成4-eg的细菌菌株，及应用于酱油发酵生产，以降低生产成本提高生产效率，为改善提升酱油品质奠定基础。

技术实现思路

1、本发明人通过长时间的实验和探索，筛选出耐盐性高、可以高效利用fa合成4-eg的细菌菌株及其培养和利用该菌株应用于酱油发酵生产的方法，对于促进改善提升酱油品质的工业化生产具有重要意义。

2、为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种高耐盐性枯草芽孢杆菌；还提供了上述菌株的培养方法和及其在提高酱油中4-乙基愈创木酚含量中的应用。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种枯草芽孢杆菌（ bacillus subtilis）jlb30-2，该菌株已于2023年05月06日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏编号为 cctcc no：m2023683。

5、所述的枯草芽孢杆菌（ bacillus subtilis）jlb30-2是从高盐稀态酱油的酱醪中分离筛选得到，该菌株耐盐性高，能够将fa转化4-eg。能够在含盐20%盐的培养基中，在45℃环境下生长良好。

6、该菌株的主要形态及生物学特征如下：该枯枯草芽孢杆菌（ bacillus subtilis）jlb30-2，在lb培养基平板上，45℃培养24小时，菌落白色、不透明，表面粗糙有皱褶，边缘不规则状，湿润粘稠且易挑起；在显微镜下观察菌体为长杆状，中生芽孢、不膨大。

7、该菌株的接种物制备包括以下步骤：将纯化的枯草芽孢杆菌（ bacillus  subtilis）jlb30-2菌株接种于产lb培养基中，按照5-15%的接种量接种于接种至接种物制备培养基，在45℃，150rpm摇瓶培养24-36h。

8、优选的，所述接种物制备培养基组成为：豆粕10%，麦芽汁5%，大豆蛋白胨0.2% ，15%氯化钠，余量的水。

9、上述的枯草芽孢杆菌（ bacillus subtilis）jlb30-2在提高酱油中4-eg酚含量中的应用，包括以下步骤：

10、s1制曲：将豆粕和炒麦按比例充分拌匀，按重量体积比加入1.1倍的水，充分拌匀，静置20min，装入三角瓶中，灭菌后冷却至室温。按原料质量(混合后总质量) 0.3%接入米曲霉孢子粉，混合均匀，在30℃生化培养箱中培养约30h左右，至曲料表面开始出现黄绿色孢子时结束培养，制成酱油曲料。

11、s2酱油发酵：将步骤s1制备的酱油曲料与18%的nacl水溶液按体积比1：2的比例混合，然后接入枯草芽孢杆菌（ bacillus subtilis）jlb30-2接种物，置45℃发酵。发酵前期五天，每天搅拌一次，之后间隔五天搅拌一次，取发酵0天，5天，10天，15天，30天，60天的样品，测定酱油发酵液中fa、4-eg、氨基酸、有机酸和葡萄糖含量，并对发酵结束的酱油进行感官品评。

12、优选的，步骤s1中所述的豆粕和炒麦按重量比4：6的比例充分拌匀。

13、优选的，步骤s1中所述的灭菌在121℃下灭菌30min。

14、优选的，步骤s1中所述的米曲霉优选为cicc2339(沪酿3.042)米曲霉菌株。

15、优选的，步骤s2中按5-15%（v/v）接入枯草芽孢杆菌（ bacillus subtilis）jlb30-2接种物。

16、优选的，步骤s2中的发酵期为60天。

17、优选的，上述的枯草芽孢杆菌（ bacillus subtilis）jlb30-2在提高酱油中4-eg酚含量中的应用，在45℃、在20% (w/v) 盐浓度以及低氧酱油酿造环境下进行酱油发酵，将酱醪中的fa转化为4-eg。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

19、1、本发明的枯草芽孢杆菌（ bacillus subtilis）jlb30-2与现有技术的提高酱油中4-eg酚含量的枯草芽孢杆菌菌株相比，能够很好地适应酱油酿造高盐、高温、低氧环境，能够在含盐20%盐的培养基中，在45℃环境下生长良好，是一株具有工业应用潜力的优良菌株。

20、2、本发明的枯草芽孢杆菌（ bacillus subtilis）jlb30-2在提高酱油中4-eg酚含量中的应用中，在45℃、在20% (w/v) 盐浓度以及低氧酱油酿造环境下能将酱醪中的fa转化为4-eg。在酱油酿造过程强化菌株jlb30-2，在发酵60天时，酱油发酵液中4-eg含量为29.75mg/l，对比例为6.85mg/l，4-eg含量提高了3.34倍，同时增加了酱油中氨基酸和挥发性风味物质的含量，对提升酱油品质具有重要的工业应用价值。