一种基于点击化学连接蛋白与核酸的试剂盒及方法与流程

本发明公开了一种基于点击化学连接蛋白与核酸的试剂盒及方法,尤其是一种在室温下于生理至弱碱性条件和叠氮基发生环加成的无铜催化点击化学反应的蛋白标记核酸方法。

背景技术：

1、随着蛋白质组学和生物医药等领域发展，多肽和蛋白质的修饰引起了人们的广泛关注，成为当前一个非常重要的研究方向。通过对多肽和蛋白的修饰，不仅可以用于探索蛋白质分子结构与功能之间的关系以及蛋白质-蛋白质相互作用，还可以应用于分子标记技术领域中，例如对酶促反应中的标记抗体进行分子标记，另外还可以对一些活性多肽和蛋白质进行改性。

2、点击化学(click chemistry)又被称为“链接化学”，实质上是通过链接各种小分子，来合成复杂的大分子。核心是开辟一整套以含杂原子链接单元c—x—c为基础的组合化学新方法，用少量简单可靠和高选择性的化学转变来获得更广泛的分子多样性，其模块化、高效和多样性以及高选择性等特点，使之特别适合偶联生物分子与人工配体，因为这类偶联反应一般需要在非常温和的条件(如生理学条件)下进行，如此一来便可保留多肽、蛋白质以及碳水化合物等生物分子的结构完整性以及基于这些结构的功能。而且点击反应后生成的氮杂唑基团具有芳香环的稳定性，不易分解，可耐受强酸、强碱，并能在多种氧化还原条件下保持稳定。

3、无铜点击化学是点击化学进一步发展的产物，提高了原始铜催化的点击反应的生物相容性，其关键是二苄基环辛炔(中文名：氮杂二苯并环辛炔胺，azadibenzocylooctyne-amine，简称：dbco)，该八元环使与叠氮化物修饰的分子的反应在没有催化剂，温度或溶剂的情况下发生，从而使研究活细胞的表面成为可能，被广泛应用于有机化学、药物化学、化学生物学、分子生物学、细胞生物学等多学科领域。目前市场上蛋白标记物类型，主要包括生物素、酶、荧光基团和放射性同位素，核酸分子作为蛋白标记物还未可见，因此，本发明要解决的技术问题就是：利用无铜点击化学反应设计一种简单、快速、低成本、高效率、安全性强的蛋白偶联核酸的方法。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于点击化学连接蛋白与核酸的试剂盒，包含与蛋白偶联的点击化学基团；以及与所述点击化学基团偶联的寡核苷酸seq no.1，所述寡核苷酸的任一端修饰了叠氮基团。

2、所述点击化学基团为无铜点击化学基团。包含n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)基团。

3、所述无铜点击化学基团包括但不限于dbco-nhs-ester和/或dbco-peg2-nhs-ester任一种。

4、本发明提供一种采用前述试剂盒偶联蛋白的方法，其中待偶联蛋白的ph值为7.2-9，浓度为0.2-2mg/ml；待偶联蛋白与点击化学基团反应浓度为摩尔比1:20～40；点击化学基团偶联成功的蛋白与seq no.1反应浓度为摩尔比1:1～10。

5、其中所述点击化学基团偶联成功的蛋白与seq no.1反应温度为20-30℃，反应时间为30-120分钟。

6、其中所述点击化学基团偶联成功的蛋白与seq no.1在避光环境进行反应。

技术特征：

1.一种基于点击化学连接蛋白与核酸的试剂盒，其特征在于，包含与蛋白偶联的点击化学基团；以及

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述点击化学基团为无铜点击化学基团。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述无铜点击化学基团包含n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)基团。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述无铜点击化学基团包括但不限于dbco-nhs-ester和/或dbco-peg2-nhs-ester任一种。

5.一种采用权利要求1所述试剂盒偶联蛋白的方法，其特征在于，待偶联蛋白的ph值为7.2-9，浓度为0.2-2mg/ml；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述点击化学基团偶联成功的蛋白与seqno.1反应温度为20-30℃，反应时间为30-120分钟。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述点击化学基团偶联成功的蛋白与seqno.1在避光环境进行反应。

技术总结
本发明公开一种基于点击化学连接蛋白与核酸的试剂盒及方法，所述方法利用无铜点击化学将蛋白与核酸偶联，这种方法不需要复杂的设备，具有操作简单，反应快速、偶联效率高、成本较低、安全性高等优点。利用该方法标记的蛋白，可应用于多个领域，如通过HCR技术进行酶联免疫信号的进一步放大，还可拓展于蛋白与蛋白、蛋白和其他小分子的偶联。

技术研发人员：赵剑,朱宇尘,陶娴,李洪波
受保护的技术使用者：上海百傲科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15