无成瘤性MDCK基因工程细胞株及其制备方法和应用

本发明涉及无成瘤性mdck基因工程细胞株及其制备方法和应用。

背景技术：

1、流感病毒是一种传播速度快且极易变异的急性呼吸道传染病病毒，接种流感疫苗是目前预防流感的最佳方法。mdck细胞对流感病毒敏感性较高且倍增时间较短，已成为流感病毒相关研究的首选细胞株。不过现有研究表明，将mdck活细胞注入balb/c裸鼠体内会形成肿瘤，即mdck细胞具有成瘤性，故在一定程度上限制了其应用。近年来发现mirna作为非编码rna，与mrna互作，参与肿瘤等多种疾病的发生发展，但mirna是否参与mdck细胞成瘤表型的调控，未见相关报道。因此，探索mirna对mdck细胞成瘤性的调节作用及其分子机制，靶向干预，有助于提高mdck细胞基质生产流感疫苗的应用安全性。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了无成瘤性mdck基因工程细胞株及其制备方法和应用。

2、本发明提供无成瘤性mdck基因工程细胞株，所述mdck基因工程细胞株为mir-2779-x过表达稳转mdck细胞株。

3、作为优选，所述mir-2779-x的核苷酸序列为：uccggcucgaaggaccau。

4、本发明还提供上述的无成瘤性mdck基因工程细胞株的构建方法，设计并构建mir-2779-x过表达慢病毒载体，转染mdck成瘤性细胞，经嘌呤霉素筛选后获得mir-2779-x过表达稳转细胞株。

5、作为优选，所述设计并构建mir-2779-x过表达慢病毒载体具体为：将mir-2779-x和gv369载体通过agei/nhei酶切位点进行连接，连接产物转化入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，挑选阳性克隆转化子进行质粒抽提，获得mir-2779过表达质粒，将mir-2779过表达质粒和慢病毒包装辅助质粒共转染至293t细胞中，收集细胞上清液进行纯化，得到mir-2779-x过表达慢病毒载体。

6、作为优选，所述转染mdck成瘤性细胞时，转染moi值为100，于37℃，5％co2条件下培养。

7、本发明还提供上述的无成瘤性mdck基因工程细胞株在流感病毒增殖培养或制备流感病毒疫苗中的应用。

8、作为优选，所述无成瘤性mdck基因工程细胞株作为细胞基质用于流感疫苗生产。

9、作为优选，将mdck基因工程细胞株接种动物后，所述mdck基因工程细胞株对接种动物不成瘤。

10、本发明首先对引进的具有成瘤性的mdck细胞株和无成瘤性单克隆细胞株进行mirna高通量测序和生物信息学分析，得到了35个显著差异表达的mirnas。利用rnahybrid+svm-light,miranda和targetscan软件对mirna靶基因进行预测，获得了如bak1、pik3r1、wnt9b、mtor、braf和il2等与肿瘤发生发展相关的功能基因。通过go和kegg对靶基因注释，差异表达基因显著富集的前20个通路中，其中与成瘤性相关的通路有：rap1信号通路、notch通路、mapk通路、vegf信号通路等肿瘤相关经典通路。构建了参与mdck细胞成瘤表型的mirna-mrna互作网络，获得了mir-2779-x，mir-424-x，mir-236-y等6个关键mirnas。利用qrt-pcr对差异表达的mirna进行验证，结果发现mir-2779-x组内平行性较好，组间差异最显著。通过western blot方法检测不同成瘤性mdck细胞中bak1蛋白表达，结果发现与高成瘤mdck细胞相比，(mdck-cb057)细胞中bak1蛋白的表达水平显著降低，且与mir-2779-x表达呈负向调控关系，初步确定mirna-2779及bak1可能是调控mdck细胞成瘤性的关键mirna和靶基因。

11、利用双荧光素酶基因报告载体验证bak13'utr与mir-2779-x的结合关系，结果发现在bak1野生型转染细胞中，mir-2779-x模拟物处理组的荧光素酶活性显著下降至对照组的80％(p＜0.05)；在bak1突变型转染细胞中，mir-2779-x模拟物处理组的荧光素酶活性显著上升为对照组的1.12倍(p＞0.05)。

12、设计并构建mir-2779-x过表达慢病毒载体，转染mdck成瘤性细胞，经嘌呤霉素筛选10代后获得mir-2779-x过表达稳转细胞株，与对照组相比mir-2779-x过表达mdck细胞mir-2779-x表达水平显著上调，bak1表达水平显著下调(p＜0.05)。参照中华人民共和国药典三部(2020年版)规定进行裸鼠荷瘤试验，结果，mir-2779-x过表达细胞株成瘤性显著降低，且裸鼠体重增长速度显著高于对照组(p＜0.05)。荷瘤试验后，提取mdck细胞、mdck细胞注射部位形成瘤体和裸鼠部分组织器官dna，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定瘤体种属来源，结果发现裸鼠瘤体可扩增出cox1片段(犬源基因)，而裸鼠其他器官未出现犬源基因表达。结论：mir-2779-x可通过抑制bak1的表达，参与调节mdck细胞成瘤表型；同时，实验构建了mir-2779-x过表达稳转细胞株，为建立低成瘤性mdck基因工程细胞株提供了新思路。

技术特征：

1.无成瘤性mdck基因工程细胞株，其特征在于：所述mdck基因工程细胞株为mir-2779-x过表达稳转mdck细胞株。

2.根据权利要求1所述的无成瘤性mdck基因工程细胞株，其特征在于：所述mir-2779-x的核苷酸序列为：uccggcucgaaggaccau。

3.权利要求1或2所述的无成瘤性mdck基因工程细胞株的构建方法，其特征在于：设计并构建mir-2779-x过表达慢病毒载体，转染mdck成瘤性细胞，经嘌呤霉素筛选后获得mir-2779-x过表达稳转细胞株。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述设计并构建mir-2779-x过表达慢病毒载体具体为：将mir-2779-x和gv369载体通过agei/nhei酶切位点进行连接，连接产物转化入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，挑选阳性克隆转化子进行质粒抽提，获得mir-2779过表达质粒，将mir-2779过表达质粒和慢病毒包装辅助质粒共转染至293t细胞中，收集细胞上清液进行纯化，得到mir-2779-x过表达慢病毒载体。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述转染mdck成瘤性细胞时，转染moi值为100，于37℃，5％co2条件下培养。

6.权利要求1或2所述的无成瘤性mdck基因工程细胞株在流感病毒增殖培养或制备流感病毒疫苗中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述无成瘤性mdck基因工程细胞株作为细胞基质用于流感疫苗生产。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将mdck基因工程细胞株接种动物后，所述mdck基因工程细胞株对接种动物不成瘤。

技术总结
本发明提供无成瘤性MDCK基因工程细胞株，所述MDCK基因工程细胞株为miR‑2779‑x过表达稳转MDCK细胞株。miR‑2779‑x可通过抑制Bak1的表达，参与调节MDCK细胞成瘤表型。本发明构建了miR‑2779‑x过表达稳转细胞株，为建立低成瘤性MDCK基因工程细胞株提供了新思路。

技术研发人员：乔自林,杨迪,石嘉琛,王家敏,刘振斌
受保护的技术使用者：西北民族大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15