一种用于对白斑综合征的基于LAMP-CRISPR/Cas12b的微流控检测方法

本发明属于分子生物学，具体涉及一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测方法。

背景技术：

1、对虾白斑综合征(white spot syndrome virus，wssv)是由白斑综合征病毒引起的暴发性流行病，白斑综合征病毒可通过水平和垂直传播感染中国明对虾(fenneropenaeus chinensis)、凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)等几乎所有对虾类甲壳动物，对虾生命周期各阶段全部易感，发病病程短，致死率极高。感染白斑综合征病毒对虾甲壳内表面初现点状白斑，继而逐渐扩大至头胸部和全身，致使甲壳呈白色；发病前期虾须、扇尾发红，身体消瘦，漫游于水面，发病后期病虾残胃或空胃，甲壳易脱离真皮，游动缓慢无力，致死率高达100％。白斑综合征病毒造成养殖对虾大规模死亡和巨大经济损失，成为全球对虾养殖业危害最大的一种病毒病。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的检测方法是减少对虾白斑综合征发生和危害的重要途径。

2、目前，对虾是否感染白斑综合征的检验通常采用病理学显微镜观察、生化测定、免疫学试验、细胞培养和pcr等，这些方法耗时、耗力、操作复杂，很难适应当前快速、准确检测的需要。成簇的规则间隔短回文重复序列(crispr)相关(cas)核酸酶方法目前已被应用于病原体检测，这种方法速度快、特异性高且操作简单。crispr/cas12a系统用于检测的原理是：cas12a酶与相应的crrna结合成cas12a-crrna复合体，一旦crrna识别到对应的靶标，cas12a酶就会被激活，随后无差别的切割附近的单链dna。基于该原理，将单链dna制备成淬灭的荧光探针，通过监测荧光信号可实现目标序列的检测。近年来，环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification method，lamp)技术与crispr/cas12b分子检测技术表现出了良好的互补性：lamp扩增具有高度特异性，可在短时间内产生高产量的扩增子，扩增子与crispr-cas系统结合，可实现对目标核酸的几个拷贝的高度特异性、灵敏的检测。同时，lamp扩增可显著提高crispr/cas12b的检测灵敏度，crispr/cas12b技术能够消除lamp非特异性扩增产生的假阳性信号。然而，样品之间的交叉污染对于分子诊断是致命的，特别是对于高度敏感的基于crispr的技术。

3、微流控芯片(microfluidics)是一种基于微流体界面精确操作的技术，是临床检测前沿最重要的检测和分析技术。通过在10-100微米通道内进行微量流体的操控、处理和反应，达到分子检测的目的。采用微流控芯片可实现对待测标本多种致病核酸的高通量快速检测，对于基于分子生物学的快速诊断发展和重大疫病的快速微量检测和疾病源头的阻断具有重大意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测方法。为了减少交叉污染的机会，申请人将等温lamp扩增和cas12b检测两步集成到一个微流控芯片之中，通过离心式微流控芯片控制靶序列在等温lamp扩增后进入cas12b检测体系检测的同时避免了气溶胶污染。该方法制作成本低、设备小型化、高通量、可同时检测多种样本、检测反应的试剂消耗微量化、分析速度快、灵敏度高，具有操作简单、自动化、集成化等特点。

2、本发明的具体技术方案如下：

3、本发明提供了一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的引物，所述引物为lamp引物组，包括外引物f3和b3、内引物fip和bip以及环引物lf和lb，具体核苷酸序列如下：

4、f3：acaacactgtgaccaagac；

5、b 3：gttccacaccttgaatgttc；

6、fip：cccaaggtgtcgctgtcaattttctgtgactgctgaggttg；

7、bip：

8、ccgcaatggaaagtctgatgttttccacgggagtgatgacaag；

9、lf：cagtcatcttgaagtagcctga；

10、lb：atgaaggaagaagatgcggat。

11、本发明还提供了一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的crrna，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.25所示。

12、本发明还提供了一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的探针，所述探针为：6-fam-ttatt-bhq1。

13、本发明还提供了一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测的试剂盒，包括所述引物、所述的crrna以及所述的探针。

14、所述的试剂盒还包括微流控芯片，所述微流控芯片包括使用所述引物等温扩增的扩增室，使用所述crrna和所述探针检测的检测室，以及连接所述扩增室与所述检测室的10-100μm的微通道。

15、本发明还提供了一种用于对白斑综合征的基于lamp-crispr/cas12b的微流控检测方法，所述方法为非疾病诊断和治疗目的，使用所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

16、(1)提取待检测样品的dna；

17、(2)在所述微流控芯片的检测室中预先装载包含所述crrna和所述探针的crispr/cas12b检测体系，封底膜；

18、(3)将步骤(1)中提取的待检测样品的dna与含有所述引物的lamp扩增体系混合，然后加入到所述微流控芯片的扩增室中，封顶膜；

19、(4)将完成步骤(2)和步骤(3)的微流控芯片置于微流控检测仪中进行扩增和检测，得到检测产物；

20、(5)将检测产物进行酶标仪荧光检测，出现荧光信号的为阳性，无荧光信号的为阴性。

21、具体的，步骤(2)中所述crispr/cas12b检测体系为：总体积为2.5μl，10×cas12b反应缓冲液0.5μl、1mg/mlaapcas12b蛋白酶0.5μl、600ng/μl crrna 0.2μl、10μm探针0.1μl，余量为ddh2o。

22、具体的，步骤(3)中所述lamp扩增体系为：10×thermopol反应缓冲液2.5μl，10mmdntp 3.5μl，100mm mgso4水溶液1.5μl，10μm fip 1.6μl，10μm bip 1.6μl，10μm f30.2μl，10μm b30.2μl，10μm lf 0.4μl，10μm lb 0.4μl，bst dna聚合酶1.5μl，待检测样品的dna1μl，用ddh2o补至25μl。

23、步骤(4)中，将上述密封好的微流控芯片置于与其配套的微流控检测仪中，设置程序，先在60℃下进行lamp扩增30min，随后通过三次短时间离心(4600rpm，30s)将lamp扩增产物从扩增室转移至检测室与cas12b检测体系混合，在温度60℃下cas12b检测20min，每分钟进行3次荧光信号收集。

24、本发明的有益效果：

25、(1)特异性强：本检测方法通过cas12b与crrna所形成的复合物对扩增后的靶序列进行检测，能特异性的识别并结合目标序列，有效的避免了假阳性现象；

26、(2)灵敏度高：本方法检测体系微量化，从侧面提高了靶序列的局部浓度，大大提高了检测限，检测下限可达到1copy/μl；

27、(3)等温高效：lamp扩增与cas12b检测均在60℃等温条件下反应，整个检测过程不存在温度变化极大的缩短了检测时间，仅需要50min即可出实验结果；

28、(4)无污染：微流控芯片高度集成化，可将等温lamp扩增和cas12b检测集成于离心式微流控芯片中，有效的避免了样品间的交叉污染以及lamp扩增后的气溶胶污染；

29、(5)便携：微流控芯片结合与其配套的微流控检测仪，设备小型化，便于携带，适合现场快速检测；

30、(6)成本低：微流控芯片制作成本低、检测反应的试剂消耗微量化，大大降低了成本。采用微流控芯片可实现对待测标本多种致病核酸的高通量快速检测，对于基于分子生物学的快速诊断发展和重大疫病的快速微量检测和疾病源头的阻断具有重大意义。