一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpAf及其制备方法与应用

本发明属于生物制药，涉及幽门螺杆菌重组抗原蛋白，具体涉及一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f及其制备方法与应用。

背景技术：

1、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)是一种感染率极高的致病菌。据相关统计数据，超过一半的世界人口感染了幽门螺杆菌。幽门螺杆菌可引起胃部持续炎症，且与许多胃肠疾病有关，包括消化性溃疡、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等。并且幽门螺杆菌感染是引发胃癌的最大危险因素，该细菌被世界卫生组织列为i类致癌物。根除幽门螺旋杆菌可以减轻胃炎，降低许多并发症的风险，临床上针对于幽门螺杆菌感染主要采用“三联”或“四联”的抗生素疗法来抑制或者清除患者体内的幽门螺杆菌。随着时间的推移，由于抗生素抗药性的增加，标准三联疗法的治愈率正在下降，尤其是克拉霉素。在克拉霉素耐药率高的地区，治疗成功率低于80％。对于这些地区，相关医学组织建议采用含铋四联疗法，然而四种药物的联合使用必然导致更高的成本和更多的副作用。

2、由于微生物耐药性导致的治疗失败案例增多，使通过根除有风险的幽门螺杆菌来预防高危人群胃癌的策略成为研究热点，开发一种有效的疫苗是预防幽门螺杆菌感染并最终预防胃癌的有效选择。针对幽门螺杆菌等粘膜病原体开发一种有效的长期保护性疫苗是非常具有挑战性的，需要从多个方面着手，首先需要确定必需的和高度保守的抗原。

3、以往对于幽门螺杆菌抗原的临床研究大多集中在幽门螺杆菌毒力因子上；包括选用幽门螺杆菌细胞毒素(如液泡细胞毒素a (vaca))，免疫调节剂中性粒细胞激活蛋白(nap)，粘连素(如幽门螺杆菌粘附素a (hpaa)或唾液酸结合粘附素(saba))，以及酸中和酶脲酶作为疫苗抗原。然而，大部分已知抗原蛋白都存在着免疫活性较低、重组表达效率低导致蛋白大量制备困难等问题。因此，对幽门螺杆菌疫苗进一步的研究急需开发出多种更加全面有效的免疫抗原。

技术实现思路

1、本发明目的旨在提供了一种新型幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f，具有良好的免疫抗原性，能够诱导高效的黏膜免疫应答。

2、本发明另一目的提供编码上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f的核酸。

3、本发明第三个目的提供上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f的制备方法，在重组表达的基础上通过包涵体洗涤、镍离子亲和层析和阳离子交换层析三步纯化得到高纯度的抗原蛋白。

4、本发明第四个目的旨在提供上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f的用途。

5、由于幽门螺杆菌表现出极高的遗传变异性，在不同的幽门螺杆菌菌株中，低保守性的抗原容易发生免疫逃避，保护率低，免疫原性较差。在幽门螺杆菌基因工程疫苗研发过程中，具有较高免疫活性的抗原蛋白种类较少，现有已知基因的重组抗原普遍存在免疫效价较低或者难以大量制备等问题。

6、目前生物信息学是生物学研究热点，本发明利用对数据库中多种幽门螺杆菌抗原蛋白结构的学习，根据“反向免疫学”原理筛选出针对幽门螺杆菌的一种新型免疫重组抗原蛋白rlpa f。重组抗原蛋白rlpa f的氨基酸序列如seq id no:1所示。稀有脂蛋白a(rlpa)是幽门螺杆菌中一种外膜蛋白，参与多蛋白和多酶分裂体及伸长酶体的组装。rlpa体系包括多个亚基蛋白质，在幽门螺杆菌菌体分裂和延伸过程中参与肽聚糖细胞壁合成或降解，此前尚未有研究表明幽门螺杆菌的rlpa f蛋白能作为幽门螺杆菌特异性抗原引起机体免疫反应。

7、本发明还提供了编码上述重组抗原蛋白rlpa f的核酸，该核酸序列如seq id no:2所示。该重组抗原蛋白rlpa f是通过选择幽门螺杆菌基因组编码蛋白中呈现高特异性的肽段编码基因作为目的基因片段，并将该目的基因片段通过原核表达载体导入宿主细胞中进行表达而制备得到，该目的基因片段具有如seq id no:2所示的核苷酸序列(下划线部分表示酶切位点)。

8、本发明还提供了上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f的制备方法，将选定的rlpaf抗原基因克隆至的蛋白表达载体，重组在工程菌内进行大规模表达，经过纯化制备后的抗原可以用作基因工程亚单位疫苗，纯化工艺简单、成本低、可操作性强。

9、本发明提供的一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f制备方法，包括以下步骤：

10、s1、质粒构建

11、将核酸序列为seq id no:2的基因作为目的基因片段，将该目的基因片段连接在表达载体质粒中构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

12、s2、诱导表达

13、将所述重组表达质粒转化至重组蛋白表达的宿主菌中进行诱导表达，收集诱导表达后的菌体；

14、s3、产物纯化

15、对收获的菌体进行破碎处理后离心并收集沉淀，将沉淀依次经包涵体洗涤、镍柱亲和层析、阳离子柱交换层析纯化后，获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f，所述重组抗原蛋白rlpa f的氨基酸序列如seq id no:1所示。

16、上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f的制备方法，重组表达质粒的构建为本领域的常规操作。本发明通过“反向免疫学”原理，设计筛选获得潜在幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f编码氨基酸序列，根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得核酸序列如seq id no:2所示目的基因片段，最后将该目的基因片段通过双酶切连接在表达载体质粒中获得重组表达质粒。本领技术人员可以采用常规手段获得重组表达质粒，本发明中，步骤s1具体包括以下分步骤：

17、s11、筛选获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f氨基酸序列，如seq id no:1所示；根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，核酸序列如seq idno:2所示；

18、s12、对s11中的得到的核酸序列进行全基因合成，并通过xho i和nco i的酶切位点连接到表达载体质粒中完成重组表达质粒构建。

19、上述步骤s12中，所述表达载体质粒为pet28a(+)。

20、上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f的制备方法，步骤s2诱导表达为本领域的常规操作，本发明对此并无特殊限制，本领域技术人员可以根据常规方式对重组菌株进行诱导表达使其产生重组抗原蛋白，本发明中，步骤s2具体操作为：将重组表达质粒转化至表达宿主菌中获得可以表达重组抗原蛋白rlpa f的重组菌株，对重组菌株进行培养至od6000.6-0.8，再于30-37℃、180-240rpm条件下，使用浓度为0.3-0.5mm异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导表达4-8h；将诱导表达后的菌液离心弃去上清液得沉淀菌体。上述所述宿主菌为大肠杆菌。

21、上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f的制备方法，步骤s3通过包涵体洗涤、镍柱亲和层析及阳离子柱交换层析对抗原蛋白进行纯化，镍柱亲和层析和阳离子柱交换层析的具体操作可以采用本领域常规操作。本发明中，所述步骤s3具体包括以下分步骤：

22、s31、包涵体洗涤

23、破菌：破碎菌体细胞，离心收集破菌沉淀；

24、洗涤：使用缓冲液a及缓冲液b交替洗涤破菌沉淀；所述缓冲液a的组成为：ph7～8的20～50mm磷酸盐缓冲液，含300～500mm nac1，50-100u核酸酶，1-2mm mgcl2；缓冲液b的组成为：ph7～8的20～50mm磷酸盐缓冲液，含0.5％-2％triton x-100，0.5-1.5mm edta，100～200mm nacl；

25、溶解：使用缓冲液c充分溶解洗涤后的破菌沉淀并离心去除不溶杂质；缓冲液c的组成为：ph7～8的20～50mm磷酸盐缓冲液，含4-8m尿素，300～500mm nac1，10～20mm咪唑；

26、过滤：取上清液经抽滤备用；

27、s32、镍柱亲和层析

28、平衡：使用缓冲液c平衡镍柱；

29、上样：将所述步骤s31的上清液进行上样；

30、复平衡：使用缓冲液c复平衡镍柱；

31、洗脱：使用缓冲液d洗脱杂质蛋白；然后使用缓冲液e洗脱目的蛋白，收集洗脱液；缓冲液d的组成为：ph7～8的20～50mm磷酸盐缓冲液，含4-8m尿素，100～200mm nacl，20～40mm咪唑；所述缓冲液e的组成为：ph7～8的20～50mm磷酸盐缓冲液，含4-8m尿素，100～200mm nacl，50～70mm咪唑；

32、s33、阳离子柱交换层析

33、平衡：使用缓冲液f平衡阳离子柱；缓冲液f的组成为：ph7～8的10～20mm磷酸盐缓冲液，含4-8m尿素；

34、上样：将所述步骤s32的洗脱液使用缓冲液f稀释后进行上样；

35、复平衡：使用缓冲液f复平衡阳离子柱；

36、复性：使用缓冲液g柱上复性；缓冲液g液组成为ph7～8的10～20mm磷酸盐缓冲液，含0.5％-1％精氨酸，10～30mm nacl；

37、洗脱：使用缓冲液h洗脱杂质蛋白；然后使用缓冲液i洗脱目的蛋白，收集洗脱液，获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f；缓冲液h液组成为ph7～8的10～20mm磷酸盐缓冲液，含0.5％-1％精氨酸，40～60mm nacl；缓冲液i液组成为ph7～8的10～20mm磷酸盐缓冲液，含0.5％-1％精氨酸，200～400mm nacl。

38、上述步骤s31中，对菌体(细胞)破碎的方法并没有特殊的限制，本发明优选采用高压均质仪或超声破碎仪破碎菌体，高压均质仪破菌参数优选为：压力600～800bar，流速100～150ml/min，重复4～8次；超声破碎仪破菌参数优选为：超声3～5s，停止3～5s，交互进行破菌20～40min。离心操作参数也可以采用本领域中常规操作参数，优选地，离心速度为10000～14000g，离心时间为20～40min。

39、上述步骤s32和s33中，镍柱和阳离子柱中的填料可以采用本领域常规填料，优选地，所述镍柱中的填料优选采用ni-琼脂糖hp(ni-sepharose hp)；所述阳离子柱中的填料优选采用sp-琼脂糖hp(sp-sepharose hp)。

40、本发明还提供了上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f的用途，用于制备幽门螺杆菌疫苗。动物实验证明重组抗原蛋白rlpa f可有效刺激机体产生较高水平的免疫应答，具有较高免疫活性，同时经免疫保护力评价实验证实rlpa f疫苗具有良好的保护效果，证明了重组抗原蛋白rlpa f具有疫苗应用价值，可以用作基因工程亚单位疫苗。而作为幽门螺杆菌膜转运蛋白中的重要组成蛋白，重组抗原蛋白rlpa f也将是幽门螺杆菌基因工程疫苗研制过程中最有希望的候选抗原之一。

41、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

42、(1)本发明提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f，具有较高的表达效率，表达的重组蛋白表达量高于35％。

43、(2)本发明提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f的制备方法，纯化工艺简单，纯化产物的纯度高于98％，重复性好，回收率高。说明该重组抗原蛋白rlpa f便于大量制备，具有良好的应用基础。

44、(3)本发明提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白rlpa f，具有较高的免疫活性和免疫保护效果；使用纯化获得的蛋白与氢氧化铝佐剂共同注射免疫balb/c小鼠，rlpa f加免疫佐剂组血清中igg水平显著高于阴性对照组(pbs组)p<0.01，免疫小鼠产生的最高抗体效价达到1:131072，免疫后抗体阳性率达到100％，证明该重组抗原蛋白rlpa f可有效刺激机体产生较高的免疫应答，具有较高免疫活性；当重组抗原蛋白rlpa f与lts63k佐剂联合滴鼻免疫小鼠后检测重组抗原蛋白rlpa f免疫小鼠产生的siga抗体效价达到1:128；免疫后抗体阳性率达到100％，说明重组抗原蛋白rlpa f能够刺激小鼠产生较高水平黏膜免疫应答。同时经免疫保护力评价实验证实rlpa f疫苗具有良好的保护效果，证明了重组抗原蛋白rlpa f具有疫苗应用价值，为重组幽门螺杆菌疫苗研制提供了新的抗原选择。