角膜类器官的制备及其在制备组织工程角膜上皮片层中的应用

本发明涉及生物，尤其涉及角膜类器官的制备及其在制备组织工程角膜上皮片层中的应用。

背景技术：

1、角膜是眼球壁外层前部的透明部分。呈圆形，占外层面积的六分之一，约1毫米厚，前面微微突起，像球面一样弯曲，有折光作用。角膜主要由无血管的结缔组织构成组成。角膜的细胞包括：角膜上皮细胞，角膜基质细胞和角膜内皮细胞，其中角膜上皮细胞每72h完成一次新陈代谢过程，新生的角膜上皮细胞由位于角结交界处的角膜缘干细胞不断分化成熟而来。

2、角膜眼屈光系统的重要组成部分，也是重要的防御屏障系统。健康的角膜对于视觉健康和人类生活至关重要。外界感染性物质、化学品、药品等物质刺激会对角膜造成严重损伤，引起并发症威胁视力甚至造成失明的严重后果。此外，角膜缘干细胞受损或缺失常引起角膜上皮细胞持续性缺损，诱发感染，结-角膜化或角膜纤维化等严重性角膜疾病，造成视力丢失。

3、目前，由于角膜缘干细胞缺乏引起的持续性角膜上皮细胞缺损尚无有效的治疗方法。理论上，可以通过移植角膜缘干细胞进行替代修复治疗，但从成体角膜缘组织分离得到的角膜缘干细胞数量有限，且体外仅仅扩增3-5代，这种角膜缘干细胞的生物学特性受得供体组织年龄和健康状态影响，且自体/异体角膜缘干细胞/组织移植由于存在对健眼的伤害，免疫排斥或细胞来源有限等问题，尚未获得大范围临床研究。

4、随着单细胞技术及组织工程学的不断发展，体外已可以成功构建与人体组织功能和结构相似的类器官。类器官的出现为探索疾病发病机制、药物开发和干细胞种子细胞的获得都带来了革命性的进步。理想的角膜缘干细胞应具有可扩增性，可规模化培养，细胞具有均一性，细胞具有较强的生物学功能。因此，胚胎干细胞或多潜能诱导干细胞分化来源的角膜缘干细胞成为理想的供体组织。

5、胚胎干细胞及多潜能诱导干细胞具有发育的全能性，理论上在适宜的培养环境下可以模拟胎儿组织器官的发育过程，可以获得足够量的组织器官特异性干细胞，但目前对该过程，尚缺乏系统性的研究。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供角膜类器官的制备及其在制备组织工程角膜上皮片层中的应用。

2、本发明提供了：拟胚体诱导培养基(3d-dkm)、外胚层分化培养基a、外胚层分化培养基b、表皮外胚层诱导培养基(edkm)、角膜类器官诱导培养基(cdkm)或角膜缘干细胞诱导培养基(eccm)中任意一种。

3、本发明中，

4、角膜缘干细胞诱导培养基包括：egf，氢化可的松，肾上腺素，胰岛素、kgf、抗生素和基础培养基。

5、本发明所述角膜缘干细胞诱导培养基用于诱导角膜类器官向角膜干细胞转化。其由egf，氢化可的松，肾上腺素，胰岛素、kgf、抗生素和基础培养基组成。其中抗生素为青霉素-链霉素，基础培养基为dmem/f12。

6、一些实施例中，所述角膜缘干细胞诱导培养基中各组分的浓度为：8～12ng/mlegf，0.1～0.8μg/ml氢化可的松，0.1～0.8μg/ml肾上腺素，0.1～0.15iu/ml胰岛素、8～12ng/ml kgf、1×青-链霉素和基础培养基。

7、一些具体实施例中，所述角膜缘干细胞诱导培养基中各组分的浓度为：10ng/mlegf，0.4μg/ml氢化可的松，0.4μg/ml肾上腺素，0.12iu/ml胰岛素、10ng/ml kgf、1×青-链霉素和dmem/f12。

8、本发明中，

9、角膜类器官诱导培养基包括kosr、fbs、neaa、glutamaxtm、抗生素、n2、胰岛素、fgf10、egf、kgf和基础培养基。

10、本发明所述角膜类器官诱导培养基用于诱导表皮外胚层向角膜类器官转化。其由kosr、fbs、neaa、glutamaxtm、抗生素、n2、胰岛素fgf10、egf、kgf和基础培养基组成。其中抗生素为青霉素-链霉素，基础培养基为knockouttmdmem。

11、一些实施例中，所述角膜类器官诱导培养基包括：1％～5％ kosr、0.8％～1.2％fbs、1×neaa、1×glutamax、0.8％～1.2％ n2、3～7μg/ml胰岛素、8～12ng/ml fgf10、15～25ng/ml egf、3～7ng/ml kgf、1×青-链霉素和基础培养基。

12、一些具体实施例中，所述角膜类器官诱导培养基由3％ kosr、1％ fbs、1×neaa、1×glutamax、1％ n2、5μg/ml胰岛素、10ng/ml fgf10、20ng/ml egf、5ng/ml kgf、1×青-链霉素和knockouttmdmem组成。

13、本发明中，

14、表皮外胚层诱导培养基包括kosr、fbs、neaa、glutamaxtm、抗生素、b27、fgf10、egf和基础培养基。

15、本发明所述表皮外胚层诱导培养基用于诱导外胚层向表皮外胚层转化。其由kosr、fbs、neaa、glutamaxtm、抗生素、b27、fgf10、egf和基础培养基组成。其中抗生素为青霉素-链霉素，基础培养基为knockouttmdmem。

16、一些实施例中，所述表皮外胚层诱导培养基包括3％～7％ kosr、1％～3％fbs、1×neaa、1×glutamaxtm、1×抗生素、1％～3％ b27、3ng/ml～7ng/ml fgf10、8ng/ml～12ng/ml egf和基础培养基。

17、一些具体实施例中，所述表皮外胚层诱导培养基包括5％ kosr、2％ fbs、1×neaa、1×glutamaxtm、1×抗生素、2％ b27、5ng/ml fgf10、10ng/ml egf和knockouttmdmem。

18、本发明中，

19、外胚层分化培养基a包括sb-505124、bfgf、iwp-2和所述拟胚体诱导培养基；

20、外胚层分化培养基b包括bmp4和所述拟胚体诱导培养基。

21、本发明所述外胚层分化培养基包括外胚层分化培养基a和外胚层分化培养基b，用于诱导拟胚体向外胚层转化。其中，外胚层分化培养基a由sb-505124、bfgf、iwp-2和所述拟胚体诱导培养基组成。外胚层分化培养基b由bmp4和所述拟胚体诱导培养基组成。

22、一些实施例中，所述外胚层分化培养基a包括：0.1～10mg/ml sb-505124、0.1～10μg/ml bfgf、1～10μg/ml iwp-2和所述拟胚体诱导培养基；所述外胚层分化培养基b包括：25～100ng/ml bmp4和所述拟胚体诱导培养基。

23、一些具体实施例中，所述外胚层分化培养基a包括：10mg/ml sb-505124、5μg/mlbfgf、10μg/ml iwp-2和所述拟胚体诱导培养基；所述外胚层分化培养基b包括：25ng/mlbmp4和所述拟胚体诱导培养基。

24、本发明中，

25、拟胚体诱导培养基包括kosr、fbs、glutamaxtm、β-巯基乙醇、neaa、抗生素和基础培养基。

26、本发明所述拟胚体诱导培养基用于胚胎干细胞向拟胚体转化。其由kosr、fbs、glutamaxtm、β-巯基乙醇、neaa、抗生素和基础培养基组成。其中抗生素为青霉素-链霉素，基础培养基为knockouttmdmem。

27、一些实施例中，所述拟胚体诱导培养基包括：10％ kosr、5％fbs、2mm glutamaxtm、0.1mmβ-巯基乙醇、1％ neaa、1％抗生素和knockouttmdmem。

28、本发明还提供了培养基组合，其包括如前所述拟胚体诱导培养基(3d-dkm)、外胚层分化培养基a、外胚层分化培养基b、表皮外胚层诱导培养基(edkm)、角膜类器官诱导培养基(cdkm)或角膜缘干细胞诱导培养基(eccm)中两种或两种以上。例如：

29、本发明提供的培养基组合包括如前所述的角膜类器官诱导培养基和角膜缘干细胞诱导培养基。

30、或本发明提供的培养基组合包括如前所述的表皮外胚层诱导培养基、角膜类器官诱导培养基和角膜缘干细胞诱导培养基。

31、或本发明提供的培养基组合包括如前所述的外胚层分化培养基a、外胚层分化培养基b、表皮外胚层诱导培养基、角膜类器官诱导培养基和角膜缘干细胞诱导培养基。

32、或本发明提供的培养基组合包括如前所述的拟胚体诱导培养基(3d-dkm)、外胚层分化培养基a、外胚层分化培养基b、表皮外胚层诱导培养基、角膜类器官诱导培养基和角膜缘干细胞诱导培养基。

33、或本发明提供的培养基组合包括如前所述的拟胚体诱导培养基(3d-dkm)、外胚层分化培养基a和外胚层分化培养基b。

34、或本发明提供的培养基组合包括如前所述的拟胚体诱导培养基(3d-dkm)、外胚层分化培养基a、外胚层分化培养基b和表皮外胚层诱导培养基。

35、或本发明提供的培养基组合包括如前所述的拟胚体诱导培养基(3d-dkm)、外胚层分化培养基a、外胚层分化培养基b、表皮外胚层诱导培养基和角膜类器官诱导培养基。

36、进一步的，本发明提供了如上所述培养基或培养基组合的应用，其包括如下i)～iii)中的任一项：

37、i)、所述的角膜缘干细胞诱导培养基在诱导角膜类器官向角膜缘干细胞转化中的应用；

38、ii)、所述的角膜类器官诱导培养基在诱导表皮外胚层向角膜类器官转化中的应用；

39、iii)、培养基组合在制备表皮外胚层中的应用；所述培养基组合包括如前所述的拟胚体诱导培养基(3d-dkm)、外胚层分化培养基a和外胚层分化培养基b。

40、本发明方法提供了一种基于角膜类器官获得角膜缘干细胞的方法，通过不同时间调控不同信号通路使胚胎干细胞分化为角膜类器官，然后利用磁珠分选特异性标志蛋白cd49f(integrinα6，整合素蛋白)阳性表达的角膜缘干细胞，且这群筛选得到的细胞特异性表达角膜缘干细胞标志蛋白p63，这群细胞可体外扩增到p10，仍保持p63阳性表达；利用角膜上皮细胞分化诱导培养基可获得成熟的角膜上皮细胞，制备组织工程角膜上皮细胞片层，并表达角膜上皮特异性标志物cytokeratin3(ck3)，cytokeratin13(ck13)，本方法制备的组织工程角膜上皮细胞片层预期将可用于角膜上皮持续性缺损疾病的治疗。在培养获得角膜缘干细胞以及角膜上皮片层的过程中，各阶段使用的培养基皆经过优化和改良，相对于其他培养基都具有更好的效果。特别是表皮外胚层诱导培养基(edkm)、角膜类器官诱导培养基(cdkm)或角膜缘干细胞诱导培养基(eccm)能够更有效的诱导获得最终的角膜缘干细胞。

41、具体的，本发明提供的角膜缘干细胞的制备方法包括：

42、将表皮外胚层以所述的角膜类器官诱导培养基重悬，在低黏附条件下培养，获得角膜类器官；

43、将cd49f阳性的角膜类器官以所述的角膜缘干细胞诱导培养基培养，获得角膜缘干细胞。

44、本发明中，所述表皮外胚层以角膜类器官诱导培养基重悬至密度为每个10cm低吸附皿约放置30～50个。

45、所述低黏附条件下培养的条件为37℃，5％co2,20％o2常氧条件培养，每隔两天更换新鲜培养基。培养至呈多发泡状，角膜类器官透亮，培养经过12天。

46、所述cd49f阳性的角膜类器官在进行成角膜缘干细胞诱导前，以胰蛋白酶和y27632处理。具体包括将cd49f阳性的角膜类器官以4ml含有10μmol/l y27632的trypleexpress消化至沉底，再以4ml含有10μmol/l y27632和5μg/ml dnase i的tryple express消化10分钟，获得细胞悬液。所述胰蛋白酶消化的温度为37℃。免疫磁珠法对细胞悬液重点细胞进行分选，cd49f+细胞接种于角膜缘干细胞诱导培养基进行培养。培养条件包括经过第一天培养后，隔日半量换液，培养5～7天至80％融合，传代直至p5代。

47、一些实施例中，所述表皮外胚层为胚胎干细胞来源的表皮外胚层。

48、具体的，所述表皮外胚层的制备包括：

49、将胚胎干细胞以所述拟胚体诱导培养基重悬，细胞活力为90％以上，加入y-27632至终浓度为20ng/ml，经培养获得拟胚体；

50、更换所述外胚层分化培养基a经培养后，以所述外胚层分化培养基b进行培养，获得外胚层；

51、更换所述表皮外胚层诱导培养基，经培养获得表皮外胚层。

52、所述胚胎干细胞进行拟胚体诱导前，经过复苏的步骤，所述复苏包括37℃水浴锅中快速解冻1min，然后用一次性巴氏吸管将h9细胞悬液转移至预先准备的装有8ml ctsessential 8胚胎干细胞专用培养基(e8，gibco)的15ml离心管中，巴氏吸管轻柔混匀2次。将装有细胞的离心管200g离心2min，弃去上清液，，再次加入e8培养液(含有终浓度为10μm的y-27632因子)重悬细胞，在包被vtn-n的容器中培养，每天更换新鲜培养基至传代。所述培养条件为37℃，5％ co2。

53、所述复苏后的胚胎干细胞，以dpbs洗涤后，经含20um y27632,0.05mg/ml dnaseⅰ的tryple express消化后，接种于拟胚体诱导培养基，密度为(1.2-1.5)×105cells/孔。每孔培养体系体积为100μl。培养条件包括37℃，5％co2,5％o2低氧条件培养3天。

54、将获得的拟胚体更换为外胚层分化培养基a进行培养(仅换液，不转板，每孔体积仍为100μl)，培养条件为37℃，5％co2,5％o2低氧条件培养，每日半量换液，共培养2天；再更换外胚层分化培养基b进行培养，培养条件为37℃，5％co2,5％o2低氧条件培养，每日半量换液，共培养2天。

55、将诱导获得的外胚层更换为表皮外胚层诱导培养基进行培养(仅换液，不转板，每孔体积仍为100μl)，培养条件为37℃，5％co2,20％o2常氧条件培养，每隔一天全量换液，共培养11天。

56、进一步的，本发明还提供了如前所述制备方法制备获得的角膜缘干细胞。

57、本发明还提供了一种组织工程角膜上皮片层的制备方法，其包括将本发明所述制备方法制备获得的角膜缘干细胞以epilifetm培养基重悬，于包被有i型胶原的基质上培养，获得组织工程角膜上皮片层。所述培养的密度为5×105/cm2，培养条件包括37℃，20％ o2条件培养，前7天隔日半量换液，之后采用隔日全量换液，共培养14天。

58、如前所述制备方法制备获得的组织工程角膜上皮片层。

59、本发明所述角膜缘干细胞和/或所述组织工程角膜上皮片层在制备治疗角膜损伤的产品中的应用。

60、一种治疗角膜损伤的产品，其包括本发明所述的角膜缘干细胞和/或所述组织工程角膜上皮片层。

61、一种治疗角膜损伤的方法，其包括给予本发明所述的角膜缘干细胞和/或所述组织工程角膜上皮片层。

62、本发明从角膜类器官中筛选cd49f阳性的角膜缘干细胞(human cornea0rganoiddeirved limbal stem cells,hco-lscs)，将其分化成角膜上皮细胞，并构建组织工程角膜上皮细胞片层，并表达角膜上皮细胞特异性标志物。从而解决了角膜缘干细胞种子来源问题，通过模拟体内角膜组织发育，培养角膜类器官，并筛选一群表达角膜缘特异性标志蛋白的细胞群，这群细胞可体外扩增到p10代，并且经过筛选后，这群细胞不具有致瘤性，可分化成成熟的角膜上皮细胞，并可用于制备组织工程化角膜上皮细胞片层。