防治作物黄萎病的靶标基因区段、dsRNA及纳米农药组合物

本发明涉及防治植物病害的靶标基因区段、dsrna及其与纳米农药复配的组合物，尤其涉及防治作物黄萎病的靶标区段，采用该靶标基因区段制备的dsrna以及该dsrna与纳米农药复配得到的防治作物黄萎病的纳米农药组合物，属于防治作物黄萎病的rna生物农药领域。

背景技术：

1、黄萎病（ verticillium wilt）是一种毁灭性的植物维管束病害，主要由植物病原真菌大丽轮枝菌（ verticillium dahliae）从植物根部侵染进入维管组织引起，在植物的整个生育期内均可能发生，严重时可导致植物死亡。大丽轮枝菌的寄主植物非常广泛，目前已经发现其可侵染超过400种双子叶植物，包括一年生草本植物、多年生草本植物和木本植物，多种具有重要经济价值的作物如棉花、番茄、马铃薯、辣椒、向日葵等都受到了大丽轮枝菌的威胁（klosterman s j, atallah z k, vallad g e, et al. diversity,pathogenicity, and managementof verticilliumspecies [j]. annual review ofphytopathology, 2009,47(1): 39-62.），其中棉花受大丽轮枝菌的影响尤为严重。

2、作为世界上主要的天然纤维作物，棉花是纺织业纤维最重要的来源之一，占人类使用纤维总量的一半（hagenbucher s, olson d m, ruberson j r, et al. resistancemechanisms against arthropodherbivores in cotton and their interactions withnatural enemies [j]. criticalreviews in plant sciences, 2013, 32(6): 458-482.）。由大丽轮枝菌引起的黄萎病属于土传病害，因此对该病的控制非常困难，目前还没有较好效果的防治药剂，因而棉花黄萎病被称作棉花的“癌症”（zhang g, zhao z, ma p,et al. integrative transcriptomic and gene co-expressionnetwork analysis ofhost responses upon verticillium dahliaeinfection in gossypium hirsutum[j].scientific reports, 2021, 11(1): 20586-20598.）。

3、rna生物农药是利用rna干扰（rna interference，rnai）原理，通过抑制生物体重要功能基因的表达，造成有害生物发育停滞或死亡，进而达到病虫害防控的目的。该技术不会改变有害生物的基因组，也不会对生态系统造成不良影响。rna生物农药具有精准、高效、绿色无污染等优势，是目前最有可能应用于病虫害防控的新技术之一。由于rnai对靶标基因沉默的特异性和高效性，可作为一种便捷手段开展病虫害防治及农药新靶标的筛选与鉴定。目前，rnai技术已被广泛研究并应用于现代农业领域。根据与病原菌侵染寄主毒力相关的基因 chs3b， ave1、 sge1和 nlp1，致病效应蛋白svrpm3a1/f1，利用这些靶标基因构建的dsrna瞬转植株或稳转植株，均能够在一定程度上抵御多种真菌病害（zhao, j. h. and h.s. guo (2022). rna silencing: from discovery and elucidation toapplicationand perspectives. journal of integrative plant biology 64(2): 476-498.）。尽管许多研究表明rna生物农药具有很强的应用前景，但其稳定性严重制约了其商业用途。作为rnai的核心成分，双链rna（dsrna）在天然状态下极其不稳定，在土壤和水环境中单独存在的dsrna在48小时内完全降解，核酸酶、雨水、紫外线和微生物等环境因素均会直接影响dsrna的稳定性（rank ap, koch a. lab-to-field transition of rnasprayapplications - how far are we.front plant sci. 2021 oct 15;12:755203.）。因此，如何保证dsrna的稳定性是实现rna生物农药商业化使用的最大挑战之一。

4、目前，中国农药目前多以乳油、可湿性粉剂等剂型为主，存在大量使用有机溶剂、粉尘漂移、水分散性差、有效利用率低、生物活性不高、农药残留与环境污染严重等问题（王安琪, 王琰, 王春鑫等. 农药纳米微囊化剂型研究进展. 中国农业科技导报, 2018, 20(2): 10-18.）。纳米粒子（1-100 nm）可快速包裹药物分子，改变农药的理化性质，提高农药的水溶性和分散性，充分发挥活性成分的生物活性，杜绝有害溶剂并最大程度减少助剂用量，克服农药残留污染（petersrjb, bouwmeester h, gottardo s, et al.nanomaterials for products and application in agriculture, feed and food.trends in food science andtechnology, 2016, 54: 155-164.）。yu等人（2019）利用单宁酸制备了阿维菌素和嘧菌酯纳米农药，二者展现出更好的耐光性和缓释能力，同时可以更好的粘附在叶面，叶面保留率增加50%以上，大幅提升了农药的利用率（yu m, sun c,xue y, et al. tannic acid-based nanopesticides coating with highly improvedfoliage adhesion to enhance foliarretention. rsc advances, 2019, 9: 27096-27104.）。selyutina等人（2020）建立了以天然多糖和多聚糖为核心的农药递送系统，不仅可以提升农药的水溶性，还可以提升农药穿透玉米和油菜种子表皮的能力，抑霉唑和咪鲜胺的表皮穿透力增强10倍以上（selyutina oy, khalikov ss, polyakov ne.arabinogalactan and glycyrrhizin based nanopesticides as novel deliverysystems for plantprotection. environmental science and pollution research,2020, 27: 5864-5872.）。

5、因此，获得有效防治作物黄萎病的靶标基因区段以及dsrna，再进一步筛选获得与该dsrna协同增效的农药并用纳米载体进行包裹得到纳米复合农药组合物，能有效提升dsrna的稳定性及防治作物黄萎病的功效。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供有效防治作物黄萎病的靶标基因区段；

2、本发明的目的之二是采用所述的防治作物黄萎病的靶标基因区段制备得到的dsrna；

3、本发明的目的之三将防治作物黄萎病的dsrna与纳米载体以及农药复合得到纳米农药组合物。

4、本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

5、本发明的一方面是提供了防治作物黄萎病的靶标基因区段，所述靶标基因区段是大丽轮枝菌 vdyth1基因的靶标基因区段，其选自ds vdyth1-1、ds vdyth1-2或ds vdyth1-3中的任何一种，其核苷序列分别为seq id.no.1、seq id.no.2或seq id.no.3所示；优选的，所述的防治棉花黄萎病的靶标基因区段是ds vdyth1-1（其核苷酸序列为seq id.no.1所示）。

6、其中，seq id.no.1（ds vdyth1-1）所述的核苷酸序列如下：

7、cacagagcgcgaagacatcacatgggcaacccaaaactcaagatgttccgatcgctgcaacctcaagcgatgcgttgctccagccgttcggagcttttggttcaactcgagctcggaaagctcacgacgtggacaaggccatcatacccaacgccaattgtcaccatacacgccactttgccagtctccagccaccagagcagcgcattcatcgacactcaatcacgaaatcacttggcagcgatattttttcaccgctcctggacggactcggcagcgcacgccacgcttgatactacttcaaacactgaacactgaacaccgacctctccccaacgcacccgcctctcgcagccagaccacgagggcccccagcaccgcaggccagccagggccagaagcccacaccatggcagcgatgacagcacacccctcgct。

8、其中，seq id.no.2（ds vdyth1-2）所述的核苷酸序列如下：

9、acaccgagccggcggcgaccttcgacttcacgcccttcctccgcgcgacgcaccagcacgccctcgccgccgactcggcgcccggcgggcagccggcgcacacgcacgcgggccgcgggccgtcgctcgtgtgcaagcactggctgcgcgggctctgcaaaaagggcgcccactgcgagttcctccacgagtacaacctccgcaagatgcccgagtgcaactttttcacgcgcaacggctactgctccaacggcgaggagtgcctctacctgcacatcgacccgcagtccaagctgccgccctgcccccactacgacatgggcttctgccccctcggccccgcctgcgccaagaagcacgtccgccgcgccctgtgcctgttctacctcgccggcttctgccccgcggggcgcgactgccgcgacggcgcccacccgc。

10、其中，seq id.no.3（ds vdyth1-3）所述的核苷酸序列如下：

11、ctacctgcacatcgacccgcagtccaagctgccgccctgcccccactacgacatgggcttctgccccctcggccccgcctgcgccaagaagcacgtccgccgcgccctgtgcctgttctacctcgccggcttctgccccgcggggcgcgactgccgcgacggcgcccacccgcggtggaggaaggacctcgagcggccgaagctcaaggtcgaggtccagcgcgaggaggaggagctcaagcgccaggaggagctcgagaggcaggccgccggcctccatgagccgcagagagatatgcgagacgacaggggcggcttcggcgacaggggggacaggaggcatggccacgggggcaggggcggcggtggtgcgggcggcggcaagtggcgcgaccgcgggggaggtggaggcggcggcaggcggttccgcggtcgtgg。

12、其中，由核苷酸序列为seq id.no.1所示的核苷酸序列转录得到dsrna，所述dsrna的其中一条rna的核苷酸序列如下（seq id.no.4）：

13、ccggcagaucugauaucaucgaugaauucgagcuccaccgcgguggcggccgcucuagaacuaguggauccaccgguuccauggcuagccacgugacgcguggaucccccgggcugcaggaauucgauaucaagcuucacagagcgcgaagacaucacaugggcaacccaaaacucaagauguuccgaucgcugcaaccucaagcgaugcguugcuccagccguucggagcuuuugguucaacucgagcucggaaagcucacgacguggacaaggccaucauacccaacgccaauugucaccauacacgccacuuugccagucuccagccaccagagcagcgcauucaucgacacucaaucacgaaaucacuuggcagcgauauuuuuucaccgcuccuggacggacucggcagcgcacgccacgcuugauacuacuucaaacacugaacacugaacaccgaccucuccccaacgcacccgccucucgcagccagaccacgagggcccccagcaccgcaggccagccagggccagaagcccacaccauggcagcgaugacagcacaccccucgcugguaccaauu。

14、本发明的另一方面是提供了含有防治作物黄萎病的靶标基因区段的载体，所述的载体可以是rna干扰载体或者是将该靶标基因区段转录得到dsrna的基因表达载体。

15、作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的rna干扰载体是gateway干扰载体，作为参考，本发明提供了一种构建gateway干扰载体的方法，包括：通过bp反应，将所述的大丽轮枝菌 vdyth1基因的靶标基因区段连接至 pdonr207中再通过lr反应，将其构建至 pk7gwiwg2(i)中得到gateway干扰载体。

16、作为本发明的一种优选的具体实施方案，所述的将该靶标基因区段转录得到dsrna的基因表达载体可以是 l4440基因表达载体，该 l4440基因表达载体内部具有一个双向t7启动子，目的基因片段可通过内部的酶切位点插入到双向t7启动子之间，在iptg的诱导下，两个反向的t7启动子发挥作用，可以形成互补的dsrna分子。

17、本发明的另一方面是提供了由大丽轮枝菌 vdyth1基因的靶标基因区段所转录得到的防治作物黄萎病的dsrna。

18、作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的由大丽轮枝菌 vdyth1基因的靶标基因区段所转录得到的防治作物黄萎病的dsrna由seq id no.4所示的核苷酸序列以及与seqid no.4所示的核苷酸反向互补的核苷酸序列组成。

19、本发明的另一方面将所述的防治作物黄萎病的dsrna与纳米载体以及具有防治作物黄萎病的农药复配在一起得到复合纳米农药组合物。

20、作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的纳米载体为树枝状大分子且经过氨基官能团功能化，其结构式为式ⅰ所示：

21、

22、其中，式ⅰ中n值为1-100中的任意整数。

23、作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的农药优选为氟唑菌苯胺（阿马士）、嘧菌酯（阿米西达）、咯菌腈（适乐时）、甲基硫菌灵或异硫氰酸烯丙酯中的任何一种，优选为氟唑菌苯胺（阿马士）。

24、作为本发明一种优选的具体实施方案，按照质量比计算，dsrna、纳米载体与农药的比例为（1-9）：1：1进一步优选，将dsrna、纳米载体与农药按照5：1：1的比例进行复配得到的复合纳米农药组合物对于黄萎病的防治效果最佳且dsrna的用量最少。

25、本发明的再一方面是将所述的靶标基因区段、由该靶标基因区段转录得到的dsrna以及由该dsrna与纳米载体以及农药复合得到复合纳米农药组合物应用于防治作物黄萎病。

26、作为本发明一种参考的实施方案，本发明提供了将所述的靶标基因区段应用于防治作物黄萎病，包括：

27、（1）构建含有所述靶标基因区段的rna干扰载体；

28、（2）将所构建的rna干扰载体转化到作物或作物细胞中；

29、（3）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因作物。

30、所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案根据可适用于转化的植物或植物细胞的类型而变化。将所述核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化和直接基因转移等。

31、作为本发明一种参考的实施方案，本发明提供了一种应用所述dsrna与纳米载体或者复合纳米农药组合物防治作物黄萎病的方法，包括：在作物播种前，将作物种子用dsrna或者复合纳米农药组合物进行拌种处理；播种后，用dsrna或者复合纳米农药组合物进行灌根处理。

32、本发明所述作物为大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物或蔬菜，包括棉花、烟草、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种。

33、本发明采用dsrna与化学药剂的纳米复配技术，以高致病力的大丽轮枝菌株v991为实验材料，首先通过体外dsrna合成技术，筛选获得能够显著抑制病原菌mrna 3'末端加工蛋白yth1并降低植株病情指数的靶标区段，然后通过与多种农药与纳米材料复配，筛选最佳的配比，进行拌种及滴灌，最终获得防治棉花黄萎病最佳的靶标基因区段并与纳米载体以及化学农药复配得到的纳米农药组合物。

34、本发明整体技术方案详述

35、为了筛选得到干扰效果最佳的靶标基因区段，根据大丽轮枝菌 vdyth1（mrna 3'-end-processing protein yth1， vdag_06824）的编码序列，设计3对特异性引物，引物两端含有 hind iii和 kpni酶切位点，分别对目的片段进行扩增，扩增获得大丽轮枝菌 vdyth1基因的靶标基因区段ds vdyth1-1、ds vdyth1-2和ds vdyth1-3，其核苷酸序列分别为seq idno.1、seq id no.2和seq id no.3所示。通过 hind iii和 kpni将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到 l4440载体中，成为rnai- vdyth1-n载体。通过pcr扩增验证和dna测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致。然后，将验证正确的阳性质料转化至大肠杆菌ht115（de3），用于dsrna的诱导表达。

36、本实验采用的 l4440表达载体内部具有一个双向t7启动子，目的基因片段可通过内部的酶切位点插入到双向t7启动子之间，在iptg的诱导下，两个反向的t7启动子发挥作用，可以形成互补的dsrna分子。工程菌株ht115，自身具有tet抗性，并且体内缺少rnaseiii样内切酶，因此在菌体内 l4440表达出的dsrna可以保持大片段形式。

37、将测序正确的单克隆加入到2×yt培养基中，加入iptg（终浓度约为0.4 mm）进行诱导后收集菌体。利用酸酚法，提取rna，以检测dsrna的表达情况，电泳发现其有大量的585bp左右的dsrna。对提取的各组rna用rnase处理2 h后，通过琼脂糖凝胶电泳可以发现总rna全部降解，dsrna仍然存在。这说明了dsrna结构相当稳定，不受rnase的影响。

38、将提取的dsrna与浓度为107cfu/ml的v991孢子悬浮液共孵育24 h，并接种长至“两叶一心”的棉花幼苗，15天后统计棉花病情指数。结果显示，与接种未处理的v991相比，接种与dsrna共孵育的v991的棉花的病情指数均有所下降，并且与ds vdyth1-1（核苷酸序列为seq id no.1所示）共孵育的孢子致病力下降最显著，初步说明孢子与dsrna共孵育可以降低棉花的病情指数，并且ds vdyth1-1区段的干扰效果最好。

39、提取棉花根部dna，利用qrt-pcr进行真菌生物量分析。结果表明，接种与dsrna共孵育的v991的棉花的真菌生物量明显降低，约为野生型的26%。为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析，可以观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约70%。这说明将ds vdyth1-1作为 vdyth1基因的靶标基因区段设计dsrna，可以有效降低病原菌的致病力。

40、选取氟唑菌苯胺（阿马士）、嘧菌酯（阿米西达）、咯菌腈（适乐时）、甲基硫菌灵和异硫氰酸烯丙酯等五种农药，分别对棉花种子进行拌种，以水作为对照。在第6 d、12 d利用农药及水进行灌根处理，每10盆棉苗灌根1 l，每盆4棵棉苗。第15 d采用蘸根法，用107cfu/ml的大丽轮枝菌的孢子悬液接种“两叶一心”的棉花幼苗。在接种后的第15 d，对植株的病害严重程度进行调查。结果显示，与清水处理相比，农药处理后的棉花的病情指数均有所下降，并且阿马士处理组病情指数下降最显著。提取转基因棉花根部dna，利用qrt-pcr进行真菌生物量分析。分析结果表明，农药处理后的棉花根部的真菌生物量明显降低，并且阿马士处理的棉花下降最明显，约为野生型的40%。

41、将spc（60.4 mg/ml）与氟唑菌苯胺（阿马士）按照质量比为1:1混合配制成纳米农药，按照不同的配比将100 ng/μl dsrna与纳米农药混合孵育，并对棉花进行拌种处理。在第6 d、12 d利用纳米农药及纳米农药复配液进行灌根处理，每10盆棉苗灌根1 l，每盆4棵棉苗。等棉花长至“两叶一心”后利用2.4方法进行接菌，并在接种15 d后根据2.5方法统计发病情况。每组接种12株棉花幼苗，接种实验重复3次，并计算防治效果（ce）。

42、室内防效测定结果显示，9种复配组合中dsrna、spc和氟唑菌苯胺（阿马士）的质量比等于或大于5：1：1时防效最好，ce可达74.65%，具有很好的增效作用，dsrna质量比用量少于5：1：1的复配防效次之。综上所述，dsrna、spc和氟唑菌苯胺三者复配药剂比单独施用效果更好，并且质量比为5：1：1的防效最好且用量最节省。

43、本发明所涉及到的术语定义

44、除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

45、术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括

46、pna（肽核酸）、在反义技术中所用的dna类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。

47、术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

48、术语“rna干扰（rna interference, rnai）”意指通过外源或内源性的双链rna在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。