一种对花叶病毒高抗性的大豆单倍型及其鉴定方法

本发明涉及大豆遗传育种，具体地，涉及一种对花叶病毒高抗性的大豆单倍型及其鉴定方法。

背景技术：

1、大豆(glycine max(l.)merr.)起源于中国，是植物油脂和饲料蛋白的主要来源。大豆花叶病毒(smv)作为大豆生产中普遍存在的病毒性病害，其地域分布广泛，危害面积大，毁灭性强。病害会导致豆荚数量减少、百粒重降低、籽粒斑驳、蛋白质和脂肪含量降低，严重影响大豆的产量和品质。一般情况下可造成减产15％～50％，在某些地区病毒比较流行的年份，可造成大面积减产70％以上，严重时甚至绝产。减少种子携带的病毒传播、喷洒化学药剂等措施均不能有效防治。因此，培育抗病品种是最经济、有效、安全的防治措施。

2、由于大豆基因组相对复杂、遗传转化效率较低等问题的存在，迄今为止已经被明确报道与smv抗性相关的基因仍相对较少。因此，利用分子生物学手段鉴定新的抗病基因，寻找可用于育种的优异等位变异对于加快大豆花叶病毒抗病品种的选育过程至关重要。目前已经发现大豆gmtoc1b基因与大豆结瘤相关，对于该基因的其他功能还有待研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种对花叶病毒高抗性的大豆单倍型及其鉴定方法。

2、本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定大豆对花叶病毒抗性的单倍型。

3、本发明的第二个目的是提供所述单倍型在鉴定大豆对花叶病毒抗性中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供大豆gmtoc1b基因的抑制剂或大豆gmtoc1b蛋白的抑制剂在提高大豆对花叶病毒抗性中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供一种提高大豆对花叶病毒抗性的方法。

6、本发明的第五个目的是提供一种构建抗花叶病毒大豆的方法。

7、本发明的第六个目的是提供一种鉴定大豆对花叶病毒抗性的方法

8、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

9、一种用于鉴定大豆对花叶病毒抗性的单倍型，所述单倍型含有snp位点1和2；

10、snp位点1位于大豆gmtoc1b基因编码区的第167个碱基；

11、snp位点2位于大豆gmtoc1b基因编码区的第1418个碱基；

12、所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为tt或cg，所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为tt的个体对花叶病毒抗性显著高于所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为cg的个体；

13、所述大豆gmtoc1b基因在ncbi登录号为or044754。

14、本发明还提供所述单倍型在鉴定大豆对花叶病毒抗性中的应用。

15、大豆gmtoc1b基因的抑制剂或大豆gmtoc1b蛋白的抑制剂在提高大豆对花叶病毒抗性中的应用，所述大豆gmtoc1b基因在ncbi登录号为or044754，所述大豆gmtoc1b蛋白在ncbi登录号为whu50589。

16、在本发明具体实施例中，所述抑制剂为sgrna、基因编辑载体和/或农杆菌中的一种或几种，所述sgrna、基因编辑载体和/或农杆菌都以核苷酸序列如seq id no：1所示的序列作为靶标。

17、在本发明具体实施例中，所述sgrna进行靶标基因编辑的靶向序列检测引物的核苷酸序列如seq id no：2～3所示的序列。

18、一种提高大豆对花叶病毒抗性的方法，抑制大豆中gmtoc1b基因或gmtoc1b蛋白的表达，所述大豆gmtoc1b基因在ncbi登录号为or044754，所述大豆gmtoc1b蛋白在ncbi登录号为whu50589。

19、在本发明中，可以用所述的抑制剂敲除大豆中的gmtoc1b基因，或构建所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为tt的个体。

20、一种构建抗花叶病毒大豆的方法，抑制大豆gmtoc1b基因或gmtoc1b蛋白的表达，所述大豆gmtoc1b基因在ncbi登录号为or044754，所述大豆gmtoc1b蛋白在ncbi登录号为whu50589。

21、在本发明中，可以用所述的抑制剂敲除大豆中的gmtoc1b基因，或构建所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为tt的个体。

22、本发明还提供一种鉴定大豆对花叶病毒抗性的方法，检测大豆的所述单倍型snp位点1和2的基因型，

23、所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为tt或cg，所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为tt的个体对花叶病毒抗性显著高于所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为cg的个体。

24、鉴定方法包括以下步骤：

25、s1：提取被鉴定的大豆样本的基因组dna；

26、s2：对基因组dna进行测序；

27、s3：以大豆gmtoc1b基因(ncbi登录号为or044754)作为参比序列，根据所述的单倍型分子标记，分析步骤s2所得测序数据，判定被鉴定的样本的品种。

28、步骤s2中，所述测序的方法可通过基因组高通量测序实现。

29、单倍型snp位点1和2的基因型依次为tt或cg，所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为tt(单倍型h1)的个体对花叶病毒抗性显著高于所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为cg(单倍型h2)的个体

30、本发明以大豆花叶病毒sc3在实施例中，进行研究和验证。

31、所述大豆gmtoc1b基因在phytozome v13.0数据库大豆glycine max wm82.a4.v1版本基因组登录号为glyma.06g196200。

32、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

33、本发明利用crispr/cas9技术敲除大豆中gmtoc1b基因获得的gmtoc1b突变体作为试验材料，与对照品种williams 82(w82)相比，接种花叶病毒sc3株系21天后，gmtoc1b突变体叶片上由超敏反应引起的坏死斑点数量显著增多，顶部叶片仅出现轻微的叶片皱缩症状，花叶病毒cp基因的表达水平显著低于对照品种w82，表明gmtoc1b突变体可限制病毒的传播过程，对花叶病毒sc3株系的抗性增强。同时，本发明在gmtoc1b基因中发现2种snp位点，snp位点1位于gmtoc1b基因编码区第167个碱基，snp位点2位于编码区第1418个碱基，大豆的snp位点1和2的核苷酸碱基都为t的单倍型，也对大豆花叶病毒具有更强的抗性，所述单倍型可用于大豆花叶病毒抗性育种工作中。

技术特征：

1.一种用于鉴定大豆对花叶病毒抗性的单倍型，其特征在于，所述单倍型含有snp位点1和2；

2.权利要求1所述单倍型在鉴定大豆对花叶病毒抗性中的应用。

3.大豆gmtoc1b基因的抑制剂或大豆gmtoc1b蛋白的抑制剂在提高大豆对花叶病毒抗性中的应用，所述大豆gmtoc1b基因在ncbi登录号为or044754，所述大豆gmtoc1b蛋白在ncbi登录号为whu50589。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为sgrna、基因编辑载体和/或农杆菌中的一种或几种，所述sgrna、基因编辑载体和/或农杆菌都以核苷酸序列如seq idno：1所示的序列作为靶标。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述sgrna进行靶标基因编辑的靶向序列检测引物的核苷酸序列如seq id no：2～3所示的序列。

6.一种提高大豆对花叶病毒抗性的方法，其特征在于，抑制大豆中gmtoc1b基因或gmtoc1b蛋白的表达，所述大豆gmtoc1b基因在ncbi登录号为or044754，所述大豆gmtoc1b蛋白在ncbi登录号为whu50589。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，用权利要求5中所述的抑制剂敲除大豆中的gmtoc1b基因，或构建权利要求1中所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为tt的个体。

8.一种构建抗花叶病毒大豆的方法，其特征在于，抑制大豆gmtoc1b基因或gmtoc1b蛋白的表达，所述大豆gmtoc1b基因在ncbi登录号为or044754，所述大豆gmtoc1b蛋白在ncbi登录号为whu50589。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用权利要求5中所述的抑制剂敲除大豆中的gmtoc1b基因，或构建权利要求1中所述单倍型snp位点1和2的基因型依次为tt的个体。

10.一种鉴定大豆对花叶病毒抗性的方法，其特征在于，检测大豆的权利要求1中所述单倍型snp位点1和2的基因型，

技术总结
本发明公开了一种对花叶病毒高抗性的大豆单倍型及其鉴定方法。本发明在大豆GmTOC1b基因中发现2个SNP位点，SNP位点1位于大豆GmTOC1b基因编码区的第167个碱基，SNP位点2位于GmTOC1b基因编码区的第1418个碱基，单倍型SNP位点1和2的基因型依次为TT的个体对花叶病毒抗性显著高于所述单倍型SNP位点1和2的基因型依次为CG的个体。本发明敲除大豆中GmTOC1b基因获得的突变体，限制了病毒的传播过程，叶片上由超敏反应引起的坏死斑点数量显著增多，顶部叶片仅出现轻微的叶片皱缩症状，花叶病毒CP基因的表达水平显著低于对照品种W82，表明突变体对花叶病毒SC3株系抗性增强。

技术研发人员：张宇航,陈丽玉,刘宝辉,孔凡江
受保护的技术使用者：广州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14