嵌合抗原受体及其用途的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种嵌合抗原受体及其用途。

背景技术：

1、免疫治疗的两种主要手段是免疫检查点抑制剂，如抗pd1/pdl1抗体、抗ctla4抗体等，和嵌合抗原受体t细胞(car-t)。car-t治疗流程是从人外周血分离出t细胞，在体外进行car基因修饰，扩增培养到一定数量后，回输患者。其中，car基因的设计研发是car-t的核心技术。将设计好的car基因转入t细胞的基因组中，t细胞就可以表达相应的car分子。car分子将使t细胞无需mhc限制性，通过单链可变区片段scfv直接识别肿瘤细胞，同时获得第一刺激信号和共刺激信号，被“一键激活”。car-t可在体内增殖，为“活的药物”，形成持续的杀伤力，car-t还可以体内释放细胞因子召集活化更多的免疫细胞协同杀死肿瘤细胞。

2、虽然现有car-t药物技术成熟，疗效显著，但是仍存在较多问题，如患者需等待制备时间(非现货)，期间可能肿瘤出现进展致使治疗风险增加或失去治疗机会；也可能制备失败致使无药可用；还存在安全性问题、售价高问题等。如要解决目前自体car-t细胞药物的主要不足(非现货、价格高)，是研制通用现货型的细胞药物，如通用型car-t、通用型car-nk等，使用同种异体的t细胞、或nk细胞，或由ips细胞诱导分化得到t细胞或nk细胞，制备成现货的car-t、car-nk，可以一批次制备几十份细胞药物，相比自体cart细胞药物一批次制备一份药物，通用型car-t、或car-nk降低了成本，使售价可以降低。

3、car-nk技术是伴随自体car-t技术同时出现的免疫细胞治疗策略，最初，为了实现现货细胞药物的目的，car修饰的nk细胞主要使用nk细胞系nk-92(能够无限扩增)，但因为nk-92的成瘤风险，在使用前需进行辐照，该car-nk-92无法体内实现扩增，报道的临床疗效不理想。nk细胞使用的car结构，需要特殊的设计。目前仍需要新的car-nk疗法来满足患者的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种嵌合抗原受体，该靶向bcma的car-nk杀伤肿瘤细胞的效果较好。

2、为了实现上述的发明目的，本发明的技术方案如下：

3、一方面，本发明提供了一种融合多肽，其包含本发明所述的嵌合抗原受体(car)和能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子，所述嵌合抗原受体包含bcma结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及cd3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；所述增强子选自il-2，il-3，il-4，il-6，il-7，il-8，il-10，il-11，il-12，il-15，il-17，il-18，il-21，il-23，其受体，其功能变体中的一种或多种。

4、在某些实施方式中，其中所述bcma结合结构域包含重链互补决定区1(hcdr1)，重链互补决定区2(hcdr2)和重链互补决定区3(hcdr3)，所述hcdr1包含seq id no:2所示的氨基酸序列，所述hcdr2包含seq id no:3所示的氨基酸序列，且所述hcdr3包含seq id no:4所示的氨基酸序列。

5、在某些实施方式中，所述hcdr1包含与seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列，所述hcdr2包含与seq id no:3所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列，且所述hcdr3包含与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。

6、在某些实施方式中，其中所述bcma结合结构域包括单域抗体。

7、在某些实施方式中，其中所述bcma结合结构域包含seq id no:8所示的氨基酸序列；或与seq id no:8所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。

8、在某些实施方式中，其中所述cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域包含seqid no:9所示的氨基酸序列；

9、或与seq id no:9所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。

10、在某些实施方式中，其中所述cd3ζ的信号传导结构域包含seq id no:5所示的氨基酸序列；或与seq id no:5所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。

11、在某些实施方式中，其中所述非抗原结合结构域包含seq id no:10所示的氨基酸序列；或与seq id no:10所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。

12、在某些实施方式中，其中所述抗原结合结构域特异性地结合肿瘤抗原。

13、在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原与非实体瘤相关。

14、在某些实施方式中，其中所述非实体瘤选自以下组：淋巴细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性和急性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、急性髓样白血病和多发性骨髓瘤。

15、在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。

16、在某些实施方式中，其中所述实体瘤选自以下组：肝癌、胃癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、食道癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。

17、在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原包括肿瘤抗原选自以下组：cd5、cd7、cd38、cs1、baffr、taci、cd19、cd20、cd22、bcma、gprc5d、mesothelin、dll1、gpc3、egfr、psma、psca、claudin18.2、her2和cd70。

18、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的c端与所述bcma结合结构域的n端连接；所述信号肽片段包含seq id no:1所示的氨基酸序列；或与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。

19、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含seq id no:11所示的氨基酸序列或seq id no:12所示的氨基酸序列。

20、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含seq id no:11所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列或seq id no:12所示的氨基酸序列。

21、在某些实施方式中，其中所述增强子包括细胞因子和/或细胞因子受体。

22、在某些实施方式中，其中所述增强子包括il-15或其功能变体，或包含il-15受体(il15r)的嵌合细胞因子受体。

23、在某些实施方式中，其中所述增强子包含seq id no:7所示的氨基酸序列；或与seq id no:7所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。

24、在某些实施方式中，其中所述嵌合抗原受体和所述增强子通过接头连接。

25、在某些实施方式中，其中所述接头包括可切割的接头。

26、在某些实施方式中，其中所述接头包括自切割肽。

27、在某些实施方式中，其中所述自切割肽包括p2a，f2a，e2a或t2a。

28、在某些实施方式中，其中所述自切割肽为t2a，所述嵌合抗原受体的n端与所述增强子的c端可以通过t2a连接，并具有如下结构：il-15-t2a-cd8sp-anti-bcma sdab-cd28(hinge/tm/intracellular)-cd3ζ；或，所述嵌合抗原受体的c端与所述增强子的n端可以通过t2a连接，并具有如下结构：cd8sp-anti-bcma sdab-cd28(hinge/tm/intracellular)-cd3ζ-t2a-il-15。

29、在某些实施方式中，其中所述接头包含seq id no:6所示的氨基酸序列；或与seqid no:6所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。

30、在某些实施方式中，其中所述融合多肽包含seq id no:13所示的氨基酸序列；或与seq id no:13所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。

31、另一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其编码本发明所述的融合多肽。

32、另一方面，本发明提供分离的一种或多种核酸分子，其包含：编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述嵌合抗原受体包含bcma结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及cd3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；和编码能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子的核苷酸序列。

33、在某些实施方式中，其中所述cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域包含seqid no:9所示的氨基酸序列。

34、在某些实施方式中，其中所述核酸分子可以包含seq id no:17所述的核苷酸序列。

35、在某些实施方式中，其中所述cd3ζ的信号传导结构域包含seq id no:5所示的氨基酸序列。

36、在某些实施方式中，其中所述核酸分子可以包含seq id no:18所述的核苷酸序列。

37、在某些实施方式中，其中所述非抗原结合结构域包含seq id no:10所示的氨基酸序列。

38、在某些实施方式中，其中所述抗原结合结构域特异性地结合肿瘤抗原。

39、在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原与非实体瘤相关。

40、在某些实施方式中，其中所述非实体瘤选自以下组：b淋巴细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病和急性髓样白血病。

41、在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。

42、在某些实施方式中，其中所述实体瘤选自以下组：肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。

43、在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原包括肿瘤抗原选自以下组：cd5、cd19、cd20和bcma。

44、在某些实施方式中，其中所述bcma结合结构域包含重链互补决定区1(hcdr1)，重链互补决定区2(hcdr2)和重链互补决定区3(hcdr3)，所述

45、hcdr1包含seq id no:2所示的氨基酸序列，所述hcdr2包含seq id no:3所示的氨基酸序列，且所述hcdr3包含seq id no:4所示的氨基酸序列。

46、在某些实施方式中，其中所述bcma结合结构域包括单域抗体。

47、在某些实施方式中，其中所述bcma结合结构域包含seq id no:8所示的氨基酸序列。

48、在某些实施方式中，其中所述核酸分子可以包含seq id no:16所述的核苷酸序列。

49、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含seq id no:11所示的氨基酸序列。

50、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的c端与所述bcma结合结构域的n端连接。

51、在某些实施方式中，所述信号肽片段包含seq id no:1所示的氨基酸序列。

52、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含seq id no:12所示的氨基酸序列。

53、在某些实施方式中，其中所述核酸分子可以包含seq id no:21所述的核苷酸序列；或与seq id no:21所示的核苷酸酸序列具有50％同一性的核苷酸分子。

54、在某些实施方式中，其中所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列包含seq id no:22所示的核苷酸序列。

55、在某些实施方式中，其中所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列包含与seq id no:22所示的核苷酸序列具有50％同一性的核苷酸序列。

56、在某些实施方式中，其中所述增强子包括细胞因子和/或细胞因子受体。

57、在某些实施方式中，其中所述增强子选自il-2，il-3，il-4，il-6，il-7，il-8，il-10，il-11，il-12，il-15，il-17，il-18，il-21，il-23，其受体，其功能变体及它们的组合。

58、在某些实施方式中，其中所述增强子包括il-15或其功能变体，或包含il-15受体(il15r)的嵌合细胞因子受体。

59、在某些实施方式中，其中所述增强子包含seq id no:7所示的氨基酸序列。

60、在某些实施方式中，其中编码所述增强子的核苷酸序列如seq id no:20所示。

61、在某些实施方式中，其中所述嵌合抗原受体和所述增强子通过接头连接。

62、在某些实施方式中，其中所述接头包括可切割的接头。

63、在某些实施方式中，其中所述接头包括自切割肽。

64、在某些实施方式中，其中所述自切割肽包括p2a，f2a，e2a或t2a。

65、在某些实施方式中，其中所述接头包含seq id no:6所示的氨基酸序列。

66、在某些实施方式中，其中编码所述接头的核酸包含seq id no:19所示的核苷酸序列。

67、在某些实施方式中，所述核酸分子包含seq id no:23所示的核苷酸序列。

68、另一方面，本发明提供一种分离的一种或多种构建体，其包含本发明所述的核酸分子或分离的一种或多种核酸分子。

69、在某些实施方式中，其包含第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述嵌合抗原受体包含bcma结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及cd3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。

70、在某些实施方式中，其中所述cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域包含seqid no:9所示的氨基酸序列。

71、在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子可包含seq id no:17所示的核苷酸序列。

72、在某些实施方式中，其中所述cd3ζ的信号传导结构域包含seq id no:5所示的氨基酸序列。

73、在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子可包含seq id no:18所示的核苷酸序列。

74、在某些实施方式中，其中所述非抗原结合结构域包含seq id no:10所示的氨基酸序列。

75、在某些实施方式中，其中所述bcma结合结构域包含重链互补决定区1(hcdr1)，重链互补决定区2(hcdr2)和重链互补决定区3(hcdr3)，所述

76、hcdr1包含seq id no:2所示的氨基酸序列，所述hcdr2包含seq id no:3所示的氨基酸序列，且所述hcdr3包含seq id no:4所示的氨基酸序列；所述第二核酸分子包含编码能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子的核苷酸序列。

77、在某些实施方式中，其中所述bcma结合结构域包括单域抗体。

78、在某些实施方式中，其中所述bcma结合结构域包含seq id no:8所示的氨基酸序列。

79、在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子可包含seq id no:16所示的核苷酸序列。

80、在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子可包含seq id no:21所示的核苷酸序列。

81、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含seq id no:11所示的氨基酸序列。

82、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的c端与所述bcma结合结构域的n端连接。

83、在某些实施方式中，所述信号肽片段包含seq id no:1所示的氨基酸序列。

84、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含seq id no:12所示的氨基酸序列。

85、在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子包含seq id no:22所示的核苷酸序列。

86、在某些实施方式中，其中所述增强子包括细胞因子和/或细胞因子受体。

87、在某些实施方式中，其中所述增强子选自il-2，il-3，il-4，il-6，il-7，il-8，il-10，il-11，il-12，il-15，il-17，il-18，il-21，il-23，其受体，其功能变体或它们的组合。

88、在某些实施方式中，其中所述增强子包括il-15或其功能变体，或包含il-15受体(il15r)的嵌合细胞因子受体。

89、在某些实施方式中，其中所述增强子包含seq id no:7所示的氨基酸序列。

90、在某些实施方式中，其中所述第二核酸分子包含seq id no:20所示的核苷酸序列。

91、在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子和第二核酸分子位于同一构建体中。

92、在某些实施方式中，其中所述嵌合抗原受体和所述增强子通过接头连接。

93、在某些实施方式中，其中所述接头包括可切割的接头。

94、在某些实施方式中，其中所述接头包括自切割肽。

95、在某些实施方式中，其中所述自切割肽包括p2a，f2a，e2a或t2a。

96、在某些实施方式中，其中所述接头包含seq id no:6所示的氨基酸序列。

97、在某些实施方式中，其包含seq id no:23所示的核苷酸序列。

98、在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子和第二核酸分子位于独立构建体中。

99、本发明所述的构建体可以存在于载体中，或可以整合进基因组中。

100、在某些实施方式中，所述的载体选自dna载体，rna载体，质粒，慢病毒载体，腺病毒载体和逆转录病毒载体。

101、另一方面，本发明提供一种细胞，其包含本发明所述的核酸分子或上述的分离的一种或多种核酸分子或本发明所述的构建体，和/或表达本发明所述的嵌合抗原受体或本发明的融合多肽。

102、在某些实施方式中，其中所述细胞包括免疫效应细胞。

103、在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括t细胞、b细胞、天然杀伤细胞(nk细胞)、巨噬细胞、nkt细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。

104、在某些实施方式中，其包括工程化的免疫效应细胞。

105、在某些实施方式中，其中所述工程化免疫效应细胞包括car-t细胞或car-nk细胞。

106、在某些实施方式中，所述的细胞表达：

107、(i)能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子；(ii)嵌合抗原受体，其包含bcma结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及cd3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。

108、所述的细胞可以是car-nk细胞，所述car-nk细胞表达：(i)能够增强所述car-nk细胞的一种或多种活性的增强子；(ii)嵌合抗原受体，其包含bcma结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及cd3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。

109、在某些实施方式中，所述的细胞表达：(i)il-15或其功能性变体；(ii)嵌合抗原受体，其包含bcma结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及cd3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。

110、所述的细胞可以是car-nk细胞，所述car-nk细胞表达：(i)il-15或其功能性变体；(ii)嵌合抗原受体，其包含bcma结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及cd3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。

111、本发明提供了一种表达il-15的免疫效应细胞，所述细胞表达il-15和嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含bcma结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及cd3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。

112、在某些实施方式中，其中所述il-15或其功能性变体作为膜结合多肽和/或分泌多肽表达。在一些实施方式中，所述il-15或其功能性变体可以作为分泌多肽表达。在另一些实施方式中，所述il-15或其功能性变体与跨膜蛋白融合。il-15的“功能性变体”包括保持全长或成熟il-15的一种或更多种功能的il-15的一部分。

113、il-15或其功能性变体可以由一种或更多种nk细胞以多种方式表达。il-15可以在nk细胞内表达并由nk细胞分泌和/或可以使用本领域已知的多种接头中的任一种直接或间接地连接。在一些具体方面，il-15可以与跨膜蛋白的全部或一部分连接。在一个方面，nk细胞表达包含与跨膜蛋白或其跨膜结构域融合的il-15的融合蛋白。

114、在某些实施方式中，所述的细胞包含：(i)第一核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含bcma结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及cd3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；和(ii)第二核酸分子，其包含编码能够增强所述工程化免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子的核苷酸序列。

115、在某些实施方式中，所述的细胞包含：(i)第一核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含bcma结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及cd3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；和(ii)第二核酸分子，其包含编码外源细胞因子il-15或其功能变体的核苷酸序列或编码包含il-15受体的嵌合细胞因子受体的核苷酸序列。

116、另一方面，本发明提供一种改造细胞的方法，所述方法包括：将第一核酸分子和第二核酸分子引入所述细胞，其中：

117、(i)所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含bcma结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括cd28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及cd3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；和(ii)所述第二核酸分子编码能够增强所述工程化免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子的核苷酸序列。

118、另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所述的融合多肽，本发明所述的核酸分子，本发明所述的分离的一种或多种构建体或本发明所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。

119、另一方面，本发明提供本发明所述的融合多肽，本发明所述的核酸分子，本发明所述的分离的一种或多种核酸分子，本发明所述的分离的一种或多种构建体，或本发明所述的细胞用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗肿瘤。

120、本发明的有益效果为：

121、本发明提供了一种嵌合抗原受体，该car分子使用单域抗体靶向识别bcma，胞外铰链区、跨膜区和胞浆区使用cd28分子的胞外区、跨膜区和胞浆区，连接cd3ζ的胞内域，通过t2a连接野生型il-15细胞因子，通过细胞实验和动物实验表明，该靶向bcma的car-nk杀伤肿瘤细胞的效果较好，进一步开发，能够作为一款car-nk细胞药物用于多发性骨髓瘤的治疗。无论细胞因子扩增制备的car-nk，或由表达mbil-21、cd137l和cd86基因改造的k562饲养细胞孵育活化制备的car-nk，靶向bcma的car-nk均具有较好的杀伤效果。动物实验显示饲养细胞活化制备的car-nk能有效抑制骨髓瘤细胞系mm.1s的增殖。