一种口蹄疫灭活抗原蛋白纯化方法与流程

本发明属于生物医药领域中的疫苗制备，具体涉及一种口蹄疫灭活抗原蛋白纯化方法。

背景技术：

1、口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的一种急性、热性、高度接触性传染的动物传染病。口蹄疫主要侵害偶蹄类动物，其临床诊断特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。成年动物感染口蹄疫后一般致死率不高但其发病率可达100％，发病动物的口、蹄部会出现大量水疱，精神沉郁，进而使得畜产量锐减。幼畜感染口蹄疫后则经常会不见症状地猝死，严重时致死率可达100％。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，因此每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患，从而给畜牧产业造成巨大的经济损失。

2、目前口蹄疫灭活抗原蛋白的纯化方法在一定程度上去除杂蛋白效果有限，并且对不同上游工艺抗原的普遍适用性较差。申请号为200910092433.3的中国专利公开了一种口蹄疫疫苗纯化抗原工艺，该专利仅用0.5％～2％的氯仿，采用沉淀法去除口蹄疫抗原液中的杂蛋白，该方法去除杂蛋白效果有限，同时，氯仿在水中具有一定的溶解度，加入氯仿沉淀杂蛋白后，氯仿会残留于上清液中，不配合后续工艺去除抗原液中残留的氯仿，直接用此液配制疫苗，存在风险。申请号为201210112283.x的中国专利公开了一种口蹄疫疫苗浓缩纯化方法，其纯化方法包括1)、用连续流离心机除去抗原中大颗粒物质；2)、用中空纤维超滤系统处理步骤1)后抗原液；3)、用peg6000处理步骤2)后循环液。该纯化方法存在明显不足：一是，仅靠离心去除抗原中大颗粒物质，抗原液中仍存有大量杂蛋白，给后续浓缩步骤带来压力，涉及：中空纤维柱截留蛋白过多，滤饼堆积，导致系统压力升高，浓缩时间延长，甚至可能引起中空纤维柱膜孔被杂蛋白污染的风险。二是，peg对口蹄疫抗原蛋白的沉淀作用依赖于抗原缓冲液的状态，不同蛋白浓度、盐浓度的样品需要最佳的peg用量存在差异。上游培养工艺的优化或变动会导致前期建立的peg沉淀方案不再适用，需要重新试验，调整下游纯化参数(peg用量)，该纯化方法对不同上游工艺抗原的普遍适用性较差。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的缺点与不足，提供一种口蹄疫灭活抗原蛋白纯化方法，通过使用pei初步除杂，可使抗原液在浓缩前就达到较为纯净的状态，使纯化效果更好，也便于后续浓缩。经中空纤维柱浓缩后，联合使用较低浓度的peg和氯仿，利用二者同时存在时的协同作用，高效去除口蹄疫抗原液中的杂蛋白。以上操作，在达到前期纯化目的的同时，结合盐浓度调节，可以使即便存在差异的抗原液也能达到较为均一的状态，使得后续的peg沉淀纯化的工艺参数具有普遍的适用性与稳定的收率。

2、本发明的目的可以通过以下方案来实现：

3、本发明提供一种口蹄疫灭活抗原蛋白纯化方法，所述方法包括如下步骤：

4、a1、向抗原液加入pei，离心去除沉淀，保留上清液；

5、a2、使用中空纤维柱对步骤a1获得的上清液(口蹄疫灭活病毒抗原液)进行超滤浓缩；

6、a3、向步骤a2浓缩过的抗原液中加入peg，搅拌混匀后，加入氯仿，再次搅拌混匀，离心去除沉淀，保留上清液；

7、a4、向步骤a3获得的上清液中，补充适量盐(调节抗原液状态)；

8、a5、向步骤a4获得的上清液中加入peg，离心收集沉淀(口蹄疫抗原蛋白)，使用复溶液溶解沉淀，过滤除菌。

9、作为本发明的一个实施方案，步骤a1中，所述抗原液为口蹄疫病毒经bhk-21细胞悬浮培养，并灭活处理后得到。

10、作为本发明的一个实施方案，步骤a1中，所述pei(聚乙烯亚胺)的分子量为1800-130000，pei在抗原液中的浓度为0.002-0.01％m/v。

11、作为本发明的一个实施方案，步骤a2中，所述中空纤维的柱孔径大小为300-500kd，浓缩至原体积的1/10-1/20。

12、作为本发明的一个实施方案，步骤a3中，所述peg(聚乙二醇)的分子量为4000-8000，peg在抗原液中的浓度为0.2-1.0％m/v；氯仿在抗原液中的浓度为2-5％v/v。

13、作为本发明的一个实施方案，步骤a3中，所述peg的分子量为6000。

14、作为本发明的一个实施方案，步骤a1或步骤a3中，所述离心去除沉淀的方法为：采用碟式离心机，转速为5000-7000rpm。

15、作为本发明的一个实施方案，步骤a4中，所述盐包括100-200mm的氯化镁或硫酸钠、500-1000mm的氯化钠中的至少一种。

16、作为本发明的一个实施方案，步骤a4中，所述盐为100-200mm的氯化镁。

17、作为本发明的一个实施方案，步骤a5中，所述peg的分子量为4000-8000，peg在上清液中的浓度为5-7％m/v。

18、作为本发明的一个实施方案，步骤a5中，所述peg的分子量为6000。

19、作为本发明的一个实施方案，步骤a5中，所述离心去除沉淀的方法为：采用碟式离心机，转速为6000-8000rpm。

20、作为本发明的一个实施方案，步骤a5中，所述复溶液为5-20mm的hepes，所述hepes包括400-600mm氯化钠、1-5mm氯化镁，ph为7.6-8.0。

21、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

22、(1)本发明通过在离心去除细胞碎片的过程中，加入pei，去除了口蹄疫抗原液中的酸性蛋白和核酸，提高了口蹄疫抗原纯度，便于后续操作，尤其是可有效避免后续浓缩过程中，口蹄疫抗原液中杂质对中空纤维柱膜孔的污染风险。

23、(2)不同于现有技术中使用高浓度peg沉淀和氯仿抽取的纯化方法，本发明通过在口蹄疫浓缩抗原液中加入较低浓度peg和氯仿，低浓度peg可竞争杂蛋白表面的水化膜，导致杂蛋白直接与缓冲液接触，可使后续加入的氯仿与杂蛋白充分作用，使杂蛋白迅速变性，达到协同沉淀杂蛋白的效果。利用两种试剂在沉淀蛋白质上的协同作用，并保留绝大部分口蹄疫抗原蛋白于上清液中，大量去除抗原浓缩液中的杂蛋白；同时极大地减少纯化过程中有毒有害试剂氯仿的使用量，避免环境污染。

24、(3)本发明通过pei和peg-氯仿协同两步去除抗原液中的杂质，并通过调节抗原液中的盐浓度，可以使不同上游培养工艺参数的抗原液达到一个低杂蛋白含量、高盐的均一状态，提高了本方法对不同上游工艺样品的普遍适用性。

25、(4)本发明的纯化方法具有操作简单、设备要求低、纯化成本低、通量高、总收率高等特点，且对环境友善，适用于工业化生产。

技术特征：

1.一种口蹄疫灭活抗原蛋白纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤a1中，所述抗原液为口蹄疫病毒经bhk-21细胞悬浮培养，并灭活处理后所得到。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤a1中，所述pei的分子量为1800-130000，pei在抗原液中的浓度为0.002-0.01％m/v。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤a2中，所述中空纤维的柱孔径大小为300-500kd，浓缩至原体积的1/10-1/20。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤a3中，所述peg的分子量为4000-8000，peg在抗原液中的浓度为0.2-1.0％m/v；氯仿在抗原液中的浓度为2-5％v/v。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤a1或步骤a3中，所述离心去除沉淀的方法为：采用碟式离心机，转速为5000-7000rpm。

7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤a4中，所述盐包括100-200mm的氯化镁或硫酸钠、500-1000mm的氯化钠中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤a5中，所述peg的分子量为4000-8000，peg在上清液中的浓度为5-7％m/v。

9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤a5中，所述离心去除沉淀的方法为：采用碟式离心机，转速为6000-8000rpm。

10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤a5中，所述复溶液为5-20mm的hepes，所述hepes包括400-600mm氯化钠、1-5mm氯化镁，ph为7.6-8.0。

技术总结
本发明涉及一种口蹄疫灭活抗原蛋白纯化方法。本发明的纯化方法包括：A1、加入PEI；A2、使用中空纤维柱进行超滤浓缩；A3、分步加入PEG和氯仿；A4、补充适量盐；A5、加入PEG后使用复溶液溶解沉淀。本发明通过保留通过使用PEI初步除杂，可使抗原液在浓缩前就达到较为纯净的状态，使纯化效果更好，也便于后续浓缩。经中空纤维柱浓缩后，联合使用较低浓度的PEG和氯仿，利用二者同时存在时的协同作用，高效去除口蹄疫抗原液中的杂蛋白。以上操作，在达到前期纯化目的的同时，结合盐浓度调节，可以使即便存在差异的抗原液也能达到较为均一的状态，使得后续的PEG沉淀纯化的工艺参数具有普遍的适用性与稳定的收率。

技术研发人员：张阿强,张岩,马贵军,孔详娟,蔡玲玉,李世瑛,何洪奎,牟思远,南亚强,兰相儒
受保护的技术使用者：申联生物医药（上海）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15