一种快速高效的走马胎毛状根诱导及增殖的培养方法

：本发明属于生物，具体涉及一种快速高效的走马胎(ardisiakteniophylla a.dc)毛状根诱导及增殖培养方法。

背景技术

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背景技术：

1、走马胎(ardisia kteniophylla a.dc)是报春花科紫金牛属植物，常绿灌木，主要分布于我国广西、广东、江西、福建等地，越南北部、印度尼西亚、马来西亚、泰国亦有，常生长于林下、溪边阴湿处。作为我国民间常用的传统民族药，走马胎素有“岭南药王”之称，其根或根茎是我国岭南少数民族地区的跌打药，有“两脚迈不开，不离走马胎”的说法。走马胎的药用功效最早文字记载于清乾隆年间的《陆川本草》与《本草纲目拾遗》中。目前，走马胎已经收录在《常用壮药100种》，并在传统瑶医理论“七十二风”中占有重要地位。此外，走马胎叶亦供药用，具有解毒去腐、生肌活血功效，也是少数民族地区传统药浴、足浴的常用保健原料。

2、现在药理研究表明走马胎主要化学成分有三萜皂苷类、香豆精类、苯醌类、苯酚类、甾醇类及挥发油类等，其中三萜皂苷类成分为主要药效活性成分，其中多种三萜皂苷都具有显著的抗肿瘤作用。到目前为止发现的走马胎中三萜皂苷元的结构类型主要为五环三萜类齐墩果烷型衍生物，主要以西克拉敏a为基础的三萜皂苷元，经过羟基化、糖基化等修饰，形成丰富多样的走马胎三萜皂苷。此外，幼苗时期的走马胎叶色紫红，拥有银白色亮纹的主侧脉，是极具观赏价值的地被植物。是一种极具研究价值的民族药用植物。

3、近年来，随着世界性开发利用天然植物药物的与日俱增，中药保健品和食疗市场迅速发展，走马胎的需求量增长也十分迅猛，使得野生植株遭到了大量采挖，野生资源锐减，野外已难见走马胎的踪影，原材料严重供不应求。2018年，走马胎也被列入《广东省重点保护野生植物名录(第一批)》。目前，还尚未有走马胎的规模化和标准化种植。而且走马胎作为灌木生长周期长，形成产量难，以常规方法育种或育苗，需要花费很长时间，因繁殖系数小、耗种量大，导致发展速度很慢且生产成本增加。并且因病虫害危害严重导致减产，严重影响了药材的产量和品质。因此，走马胎亟待进行深入的保护研究。同时，走马胎中化合物成分复杂、含量低，性质不稳定易分解等使得走马胎三萜皂苷、岩白菜素等重要代谢物获取难度较大。野生走马胎资源已经是野外重点保护植物，难以大规模用于相关药用成分的提取，而组织培养技术无法建立满足生产需求的高效走马胎生物反应器。发根农杆菌侵染植物所形成的毛状根(hair root)，是一种恶性增殖的器官，相对于常规细胞培养，其具有激素自养、生长迅速、周期短等特点，可在实验室条件下进行大量增殖培养，同时它起源于单细胞，遗传性状稳定，拥有亲本植株的特征次生代谢途径。由于其生长迅速且遗传性状稳定十分有利于天然药物的开发与利用，成为药用植物次生代谢产物生产的重要原料，目前，人参、黄芪、颠茄、丹参、甘草和朱砂根等多种药用植物建立了毛状根诱导和培养体系，大约有百种药用植物的毛状根被成功诱导。结合遗传转化，以毛状根为载体，通过筛选获得优化条件后，可获得更高产量的有效药用成分。对于某些提取受限的野生药用植物资源来说，毛状根培养发展是因势利导，成为一项由基因工程和细胞工程相结合的新技术。目前国内外尚未见转化走马胎发根成功的报道。

4、建立走马胎毛状根诱导技术体系，利用走马胎根系拥有亲本特征次生代谢途径，可以作为走马胎重要次生代谢物的扩大生产的生物反应器，也为进一步挖掘珍贵民族药用植物走马胎中高价值代谢物研究打破了植物原材料限制。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、有鉴于此，本发明提供一种利用发根农杆菌诱导走马胎产生毛状根及增殖的快速高效的走马胎毛状根诱导及增殖的培养方法。对利用农杆菌介导转化走马胎毛状根为生产走马胎三萜皂苷及岩白菜素等次生代谢产物提供了新的途径，对建立走马胎遗传转化体系也具有重要意义。

2、本发明提供了一种快速高效的走马胎毛状根诱导及增殖的培养方法，包括如下步骤：

3、步骤一、走马胎外植体的制备

4、将走马胎成熟的种子用水浸泡，选取饱满的种子置于容器中用流水冲洗，灭菌后种子至1/2ms固体培养基上培养，获得走马胎无菌苗；

5、步骤二、发根农杆菌的活化和侵染液的制备

6、将发根农杆菌接种到含卡那霉素的ty液体培养基中培养至od 600＝0.6-0.9，取菌液离心去上清液，加入等体积的1/2ms液体培养基，重悬混匀得到侵染液；

7、步骤三、发根农杆菌浸染及共培养

8、(1)外植体的预培养

9、选取步骤一获得的长势良好的无菌苗，在超净工作台用无菌的手术刀将叶片或茎段切段，将处理过的外植体接种在1/2ms固体培养基上培养，完成外植体的预培养阶段；

10、(2)菌液共培养

11、取出预培养后的外植体，放置于经步骤二活化的侵染液中，加入乙酰丁香酮，置于摇床震荡培养后，将浸染后的外植体取出，并用无菌滤纸吸干表面残余的菌液，接种到1/2ms固体培养基上置于人工气候箱中培养2～3d；

12、(3)除菌培养

13、在无菌条件下，将完成共培养的外植体转移至含有300～500mg/l头孢噻肟钠的1/2ms固体培养基中于人工气候箱中黑暗培养，每隔7-10d转接一次，并将头孢噻肟钠的浓度降低，直至培养到在不含头孢噻肟钠的培养基中培养，且没有菌落生成；

14、步骤四、继代和扩大培养

15、将诱导出的毛状根的根株在无菌环境中切下培养，放置于1/2ms固体培养基一段时间后，挑选根系粗壮、分支较多、生长迅速、无向地性的毛状根转移到b5液体培养基中进行扩大培养，黑暗中震荡培养，毛状根大量生长。

16、优选，所述的外植体为茎段；所述的将处理过的外植体接种在1/2ms固体培养基上培养，其预培养时间为2天；是将发根农杆菌接种到含卡那霉素的ty液体培养基中培养至od600＝0.7浸染用菌液浓度od 600为0.7；所述的步骤(2)中的置于摇床震荡培养，其培养时间为30min，接种到1/2ms固体培养基上置于人工气候箱中培养2d；所述的b5液体培养基是含维生素的b5液体培养基，其是b5+蔗糖25g/l+维生素，ph为5.8-6.0，所述的维生素是肌醇100mg/l、盐酸1mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l和盐酸硫胺素10mg/l，培养条件为25℃，100rpm黑暗中震荡培养。

17、作为优选，步骤一中所述的消毒是体积分数75％医用酒精消毒20-30s后；再将种子置于质量分数10％次氯酸钠溶液中消毒3～5min，所述的灭菌后种子至1/2ms固体培养基上培养，其培养条件是温度25±2℃、光周期为10～16h。

18、作为优选，步骤一所述的将叶片或茎段切小段是叶片大小为1cm×1cm，将茎段斜切成长度0.5～1cm的小段。

19、作为优选，步骤二所述的将发根农杆菌接种到含卡那霉素的ty液体培养基中培养至od 600＝0.6-0.9是将发根农杆菌ara4接种于含卡那霉素50mg/l的ty液体培养基中，在28℃、160rpm震荡培养24小时，至od 600＝0.7。

20、作为优选，步骤二所述的取菌液离心去上清液是在6000rpm离心10min，去上清液。

21、作为优选，所述ty液体培养基的配方为：胰蛋白胨(tryptone)5g+酵母提取物(yeast extract)3g，ph为7.2。

22、作为优选，步骤一～三中所述的1/2ms固体培养基为1/2ms+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，ph为5.8-6.0，所述的1/2ms液体培养基是1/2ms固体培养基缺少琼脂。

23、作为优选，步骤三中所述的加入乙酰丁香酮，置于摇床震荡培养后是加入100μmol/l乙酰丁香酮，置于28℃、90～100rpm摇床震荡培养30min后。进一步优选为100rpm。

24、作为优选，步骤三中所述的每隔7-10d转接一次是每10d更换一次，除菌培养基中头孢噻肟钠cef浓度按照100mg·l-1依次递减。

25、经由上述的技术方案可知，本发明的快速高效的走马胎毛状根诱导及增殖的培养方法，其突出的优点在于：

26、1、采用本方法进行走马胎毛状根诱导，毛状根的诱导率高，且不易染菌，达50％以上，同时所需材料容易获得、操作简单、易行、成本低。

27、2、采用本方法进行走马胎毛状根诱导，获得的毛状根在无任何外源激素的培养基中容易生长，且具有生长速度快、遗传稳定性好、合成能力强且稳定，是生产次生代谢产物理想的载体。

28、3、通过本发明获得的毛状根，在b5(含维生素)液体培养基中易于进行大量繁殖培养，可进行大规模生产以作为工业用走马胎的替代资源来提取次生代谢产物。

29、本发明通过利用发根农杆菌成功诱导走马胎产生毛状根，其具有更强的产生次生代谢产物的潜能。发根可以在培养基内产生次生代谢产物，并可以通过人为的改变生长环境，诱导次生代谢产物不断产生，并分泌于培养基内，便于收集和应用，是取代人工种植提取走马胎次生代谢产物的有效途径，也为该物种的遗传转化体系建设及其进一步的应用打下了良好的基础。

30、本发明关于走马胎诱导方法操作简单、高效、诱导率高，为利用发根农杆菌转化走马胎毛状根为生产走马胎三萜皂苷等次生代谢产物提供了新的途径，可用于大规模生产工业走马胎药用成分的替代资源。同时，对后续建立走马胎遗传转化体系也具有重要意义。