水稻OsERF103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用

本发明涉及植物基因工程，具体而言，涉及一种水稻oserf103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用。

背景技术：

1、水稻(oryza sativa l.)是世界三大农作物之一，作为主食养活了世界一半以上的人口。同时水稻也是我国的主要粮食作物之一。干旱是限制水稻生长、影响水稻发育及水稻产量的主要因素，作为重要的粮食作物，水稻全生育期消耗水分高达8884.5m3/hm2(张鸿等，2012)。随着温室效应加剧，全球干旱区域的面积在不断增加，部分地区出现了极端干旱缺水的情况。因此，在传统淹灌栽培方式下要想维持水稻正常生产，就需要提供充足的水分。然而，目前存在水资源匮乏以及降水区域分布不均等问题，这使得农业生产与水资源短缺的矛盾日益突出，并且持续的重度干旱还会导致作物的大面积减产甚至绝收，严重威胁粮食安全(lesk等，2016；lobell等，2011)。因此，深入开展水稻响应干旱胁迫的遗传基础和分子机制研究，挖掘抗旱相关基因，可以为培育和改良抗旱水稻新品种提供理论依据，同时也对保障粮食安全，实现农业可持续性发展具有重要的理论价值和现实意义。

2、水稻在面对各种生物和非生物胁迫的逆境时，为了生存繁衍，水稻进化出了一系列适应逆境的机制。其中，通过转录因子调控胁迫响应基因的表达来提高水稻的适应能力是其中最重要的组成部分之一。目前已知的参与干旱胁迫响应的转录因子有zfp类、bzip类、erf/ap2类、myb/myc类和nac类等。ap2/erf是水稻中最大的转录因子家族之一，广泛参与水稻生长发育和胁迫应答等多种生物学进程。当逆境来临时，水稻ap2/erf转录因子可通过结合逆境相关基因启动子区的顺式作用元件如gcac(a/g)n(a/t)tccc(a/g)ang(c/t)、gcc-box(agccgcc)、dre/crt(a/gccgac)等调控靶基因的表达，以提高水稻对各种胁迫的适应性(shoji和yuan，2021)。rashid等(2012)将170个水稻ap2/erf转录因子家族基因分为ap2(apetala2)、rav(related to abi3/vp1)、dreb(dehydration-responsiveelementbindingprotein)、erf(ethylene responsive factor)和soloist 5个亚家族。其中，erf和dreb亚家族在水稻响应逆境过程中扮演着十分重要的角色。目前为止有关erf和dreb亚家族成员在水稻抗逆方面的报道主要集中在抗病、抗旱、抗盐等领域。例如，过表达oserebp1(ethylene responsive elementbindingprotein 1)可以提高ja和aba含量，增强水稻对白叶枯病菌的抗性(jisha等，2015)；oserf83与gcc-box结合调控下游基因表达，提高稻瘟病抗性(tezuka等，2019)；oserf3是类受体激酶gudk(growth under droughtkinase)的磷酸化底物。过表达gudk和oserf3均会导致水稻耐旱性降低，osderf1(drought-responsive erf genes)和oserf109可直接与oserf3启动子中的gcc-box或dre元件结合，激活其表达，负调控抗旱能力(wan等，2011；zhang等，2013)。在盐胁迫研究方面，osserf1(saltresponsive erf1)是响应盐胁迫中一个核心的正调控因子，当水稻遭遇盐胁迫后，map3k6-mkk4-mapk5通路被激活，osserf1蛋白第105位ser残基被mapk5磷酸化，增强其转录激活活性，提高耐盐能力。同时，osserf1受盐胁迫诱导表达，osserf1识别并结合map3k6和mapk5的a/gccgac基序直接激活靶基因及其自身的表达，形成一个反馈调节机制(schmidt等，2013)。oserf922过表达使水稻中na+/k+比值增加，导致水稻对盐胁迫的耐受性变弱(liu等，2012)。然而，有关oserf103在水稻响应干旱中的功能和应用还未见报道。

3、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供水稻oserf103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用以及提供一种培育耐受干旱胁迫的转基因植物的方法，为植物抗旱分子机制研究以及培育抗旱新品种提供理论基础。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

3、在一个方面，本发明提供了水稻oserf103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用，所述水稻oserf103蛋白的氨基酸序列如seq idno.2所示。

4、本发明构建了水稻oserf103的超表达载体和oserf103基因突变体，并通过农杆菌侵染水稻愈伤组织的方法来获得过表达阳性植株以及突变体阳性植株，获得4个突变体转基因株系以及6个表达倍数有不同程度上调的过表达转基因株系，通过对其进行功能鉴定，发现oserf103的转录表达量随着干旱处理的过程逐渐升高，随着复水的过程逐渐降低，说明oserf103在转录水平响应干旱胁迫。对转基因株系进行耐旱性分析，表明oserf103突变体均表现出干旱敏感表型，存活率显著低于野生型；而超表达植株均表现出抗旱的表型，且存活率与oserf103转录本的上调水平呈正相关，说明oserf103是水稻响应干旱的正调控因子。

5、本发明中“水稻oserf103蛋白”涵盖在seq id no.2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质以及将seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

6、在一个实施方案中，所述水稻oserf103蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。

7、本发明涵盖与seq id no.1所示核苷酸序列具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上相似度且具有相同功能的序列。本发明也涵盖与seq idno.1所示的核苷酸序列具有一个或几个碱基的取代、替换、缺失和/或添加且具有相同功能的序列。

8、在另一个方面，本发明包含水稻oserf103蛋白的编码基因的生物材料在提高植物干旱耐受性中的应用，其中，所述生物材料包括：

9、(a)含有如seq id no.1所示核苷酸序列的核酸分子的表达盒；

10、(b)含有(a)中所述表达盒的重组载体；

11、(c)含有(a)中所述表达盒或含有(b)中所述重组载体的重组微生物；

12、(d)含有(a)中所述表达盒或含有(b)中所述重组载体的重组细胞。

13、在一个实施方案中，本发明包含水稻oserf103蛋白的编码基因的转基因植物。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。所述转基因植物不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。

14、在一个实施方案中，所述重组载体为重组表达载体，优选为目的基因(水稻oserf103基因)的过表达载体。

15、在一个实施方案中，重组表达载体包含启动目的基因转录的转录子。为了获得目的基因过表达，重组表达载体所包含的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。

16、在一个优选的实施方案中，所述过表达载体含有ubiquitin启动子或camv 35s启动子；所述目的基因的核酸分子可操作地连接至启动子。

17、在一个实施方案中，重组表达载体包含合适的转录终止子，所述终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子等。

18、在一个实施方案中，所述重组载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，例如包括但不限于pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb等载体。

19、在一个实施方案中，所述重组载体还包括便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的基因)。

20、在一个实施方案中，所述微生物为农杆菌，优选地，所述微生物为农杆菌eha105。

21、在一个实施方案中，所述重组载体为ubi-xx-3flag。

22、在一个实施方案中，所述重组细胞包括水稻oserf103基因的过表达载体或水稻oserf103基因的过表达突变体。

23、在一个实施方案中，所述应用为使水稻oserf103蛋白或其编码基因过量表达来提高植物的干旱耐受性。

24、在另一个方面，本发明提供了一种培育耐受干旱胁迫的转基因植物的方法，通过基因工程的方法提高所述植物中oserf103基因的表达水平或oserf103蛋白的活性，得到干旱耐受性提高的转基因植物。

25、在一个实施方案中，提高所述植物中oserf103基因的表达水平的方法包括将oserf103蛋白的编码基因导入植物组织或植物细胞中。

26、本发明也提供了一种提高植物干旱胁迫耐受性的方法，包括1)构建含有水稻oserf103基因的表达载体；2)将所构建的表达载体转化到植物或植物细胞中；3)培育获得转基因植物的植株。

27、在本发明中，表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体，直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞；例如通过浸染愈伤组织导入水稻。

28、在一个实施方案中，含有所述目的基因的重组表达载体侵染目的植物后，筛选阳性植株，获得与正常植物相比抗旱性能增强的转基因植物。

29、在具体的实施方案中，所述转基因植物(导入oserf103基因)的抗旱性提高表现为：转基因植物的抗旱性高于非转基因植物(野生型植物)或转入不含目的基因的空载体的植物；特别地，转基因植物的耐旱性水平更高，并且其在干旱胁迫下，oserf103基因的表达量也更高，转基因植物的存活率也比野生型更高。

30、在一个实施方案中，重组表达载体转化宿主包括多种植物。

31、在一个实施方案中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于拟南芥、水稻、油菜等。

32、在一个优选的方案中，所述植物为水稻，优选为野生型水稻(日本晴)。

33、本发明的有益效果：

34、本发明明确了oserf103基因为水稻耐旱性的重要基因，该基因可响应干旱胁迫，在水稻抗旱中发挥正调节功能。水稻基因oserf103或其编码蛋白可应用于提高植物的抗逆性(抗旱性)。

35、本发明提供了通过提高oserf103基因的表达增强或提升植物干旱耐受性方面的应用，从而可获得抗旱性提高的植物，具有较高的应用价值，为培育具有耐旱性的转基因植物的研究奠定基础。通过使水稻oserf103蛋白或其编码基因过量表达来培育耐受干旱胁迫的转基因植物可以提高植物在干旱胁迫环境下的存活率，有利于保障粮食安全，实现农业可持续性发展。