OsOSD1基因在水稻染色体加倍中的应用

本发明属于分子育种，具体涉及ososd1基因在水稻染色体加倍中的应用。

背景技术：

1、水稻是我国重要的粮食作物，探索其育种新途径对于保障国家粮食安全具有重要的战略意义。多倍化是一种具有良好前景的作物育种探索策略，对多倍体水稻进行探索，有利于拓展水稻育种的空间。目前，水稻多倍化育种研究已取得了一定的研究进展。但四倍体水稻总体遗传多样性仍十分有限，因此，持续不断地加倍新的同源四倍体水稻以丰富遗传多样性是该领域的必经之路。

2、目前，水稻品种的染色体加倍工作主要采用的方法是利用低浓度的秋水酰碱处理愈伤组织或幼芽。这种方法使用比较广，说明染色体加倍的需求较大，但以秋水酰碱处理法为代表的化学试剂处理法有以下几点局限：(1)秋水酰碱有剧毒，对操作者不安全；(2)诱导成功率低，而且容易产生非整倍体；(3)化学试剂的处理对植株有毒性作用，处理后样品存活率低。因此，有必要开发绿色安全高效的水稻染色体加倍法。

3、ososd1基因影响水稻减数第二次分裂，它的变异会导致减数第二次分裂中止，进而形成双倍体的雌雄配子。这使得ososd1基因具备研发水稻染色体加倍新技术的潜力。目前有研究通过同时突变三个基因ososd1、pair1、osrec8而产生四倍体后代，但这些四倍体后代会持续发生染色体加倍，形成八倍体直至植株无法存活，得不到倍性稳定的同源四倍体水稻(mieulet et al.2016；wang et al.2019)。目前，ososd1基因在培育同源四倍体水稻新种质中尚未找的有效的应用方法。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明通过rnai技术抑制ososd1基因(loc_os02g37850/os02g0591500)的功能，促使转基因植物染色体加倍，再在下一世代中去除转基因元件，从而得到倍性稳定的同源四倍体水稻新品系，为ososd1基因在培育同源四倍体水稻新种质中的应用提供了有效的途径。

2、为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

3、本发明第一方面提供了ososd1基因在水稻染色体加倍中的应用。

4、优选地，所述ososd1基因还包括与其相关的生物材料，所述相关的生物材料包括编码ososd1基因的蛋白，含有ososd1基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5、本发明第二方面提供了一种基于ososd1基因的水稻染色体加倍方法，具体为：以ososd1基因的外显子为干涉靶标，通过rnai技术抑制二倍体水稻中ososd1基因的功能，使其发生一次染色体加倍，然后去除转基因元件，使其倍性稳定，从而获得倍性稳定的同源四倍体水稻。本发明利用rnai转基因技术，一次性靶向抑制ososd1基因的功能，实现水稻的染色体倍性转化。

6、作为本发明的一个优选实施方式，所述的一种基于ososd1基因的水稻染色体加倍方法，包括以下步骤：

7、s1、将seq id no.1所示的干涉元件序列和seq id no.2所示的干涉元件序列的反向互补序列重组到pylrnai.5载体中构建成ppi载体，所述pylrnai.5载体中所用的intron序列如seq id no.3所示；

8、s2、用携带ppi载体的农杆菌侵染二倍体水稻的愈伤组织，并通过组织培养获得转基因幼苗，使用特异标记检测t-dna鉴定阳性转基因植株；

9、s3、将阳性转基因植株t0世代正常培养至成熟，收获种子；该世代的转基因植株在ppi载体的作用下，雌雄配子发育过程中的减数分裂第二次分裂会缺失，形成的水稻种子外形与二倍体种子无异，但其中的胚为同源四倍体，胚乳为同源六倍体。由于农杆菌侵染获得的转基因植株多为半合状态(转基因片段只存在于一条同源染色体)，t0代结的种子中会出现分离，即一部分种子含有ppi载体转基因片段，而一部分种子不含有ppi载体转基因片段(这部分种子后代不会再发生染色体加倍)。

10、s4、将s3的种子发芽成t1代幼苗后，种植成植株，并使用特异标记检测t-dna，筛选不含t-dna的植株种植至大田，得到的不含t-dna的植株及其后代即是同源四倍体水稻。

11、优选地，所述二倍体水稻包括但不限于台中65。

12、优选地，s2和s4中所述的特异标记包括seq id no.4所示的htp-f和seq id no.5所示的htp-r。

13、优选地，s2和s4中使用特异标记检测t-dna的pcr反应程序为：95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，36个循环。

14、优选地，s1利用高保真pcr反应体系扩增获得seq id no.1所示的干涉元件序列和seq id no.2所示的干涉元件序列的反向互补序列。

15、优选地，s1通过双酶切-连接或者同源重组的方式将seq id no.1所示的干涉元件序列和seq id no.2所示的干涉元件序列的反向互补序列重组到pylrnai.5载体中。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

17、本发明公开了ososd1基因在培育同源四倍体水稻新种质中的有效应用方法，通过rnai技术抑制ososd1基因的功能，促使转基因植物染色体加倍，再在下一世代中去除转基因元件，从而得到倍性稳定的同源四倍体水稻新品系，为同源四倍体水稻的培育提供了绿色安全高效的水稻染色体加倍方法。本发明具有以下优点：

18、(1)不需要使用高毒试剂，对操作者安全；

19、(2)加倍效果稳定，成功率高。经研究发现，在22个t0转基因植株中，有20个植株后代全部加倍为同源四倍体水稻，成功率达90.91％；

20、(3)操作简单，无需改动ppi载体即可直接用于其它水稻品种的染色体加倍；

21、(4)相较于基因编辑等序列突变方法导致的ososd1永久性功能丧失，本方法利用rnai技术对ososd1进行一次性的功能抑制，从而获得稳定的同源四倍体水稻品系。

技术特征：

1.ososd1基因在水稻染色体加倍中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ososd1基因还包括与其相关的生物材料，所述相关的生物材料包括编码ososd1基因的蛋白，含有ososd1基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.一种基于ososd1基因的水稻染色体加倍方法，其特征在于，以ososd1基因的外显子为干涉靶标，通过rnai技术抑制二倍体水稻中ososd1基因的功能，使其发生一次染色体加倍，然后去除转基因元件，使其倍性稳定，从而获得倍性稳定的同源四倍体水稻。

4.根据权利要求1所述的一种基于ososd1基因的水稻染色体加倍方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种基于ososd1基因的水稻染色体加倍方法，其特征在于，所述二倍体水稻包括台中65。

6.根据权利要求4所述的一种基于ososd1基因的水稻染色体加倍方法，其特征在于，s2和s4中所述的特异标记包括seq id no.4所示的htp-f和seq id no.5所示的htp-r。

7.根据权利要求4所述的一种基于ososd1基因的水稻染色体加倍方法，其特征在于，s2和s4中使用特异标记检测t-dna的pcr反应程序为：95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，36个循环。

8.根据权利要求4所述的一种基于ososd1基因的水稻染色体加倍方法，其特征在于，s1利用高保真pcr反应体系扩增获得seq id no.1所示的干涉元件序列和seq id no.2所示的干涉元件序列的反向互补序列。

9.根据权利要求4所述的一种基于ososd1基因的水稻染色体加倍方法，其特征在于，s1通过双酶切-连接或者同源重组的方式将seq id no.1所示的干涉元件序列和seq idno.2所示的干涉元件序列的反向互补序列重组到pylrnai.5载体中。

技术总结
本发明属于分子育种技术领域，具体涉及OsOSD1基因在水稻染色体加倍中的应用。为了开发OsOSD1基因在培育同源四倍体水稻新种质中的有效应用方法，本发明通过RNAi技术抑制OsOSD1基因的功能，促使转基因植物染色体加倍，再在下一世代中去除转基因元件，从而得到倍性稳定的同源四倍体水稻新品系。本发明利用RNAi转基因技术，一次性靶向抑制OsOSD1基因的功能，实现水稻的染色体倍性转化，为同源四倍体水稻的培育提供了绿色安全高效的水稻染色体加倍方法。

技术研发人员：陆紫君,刘向东,祝连君,吴锦文,梁国彬
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15