一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白、制备方法及应用与流程

本申请涉及重组蛋白，更具体地说，它涉及一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白、制备方法及应用。

背景技术：

1、猫皮屑过敏原feld1是34kd二聚体蛋白，由ch1与ch2两条蛋白质链先串联再聚合而成，其蛋白质构象是如“蝴蝶状”的双链二聚体。蛋白在重组过程中大多以单链或双链单体形式存在，然而，具有天然状态的蛋白才能激发人体过敏反应。

2、当前医学过敏原检测原料大多为天然提取，从多种属猫皮屑中，对目标致敏蛋白进行多方式、多次的纯化分离。当前重组的feld1为单链或双链单体，与天然状态区别极大，很难形成具有生物学活性的“蝴蝶状”双链二聚体。

3、由于猫的种属限制，天然提取目标致敏蛋白含量及纯度都极低，且纯化过程繁琐，导致蛋白在纯化过程中降解失活，造成过敏原检测差异极大。同时，重组feld1为单链或双链单体形式对过敏人群ige的反应极低。

技术实现思路

1、为了提高猫皮屑过敏原检测的准确性，降低天然过敏原提取的难度，本申请提供一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白、制备方法及应用。

2、第一方面，本申请提供一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，采用如下的技术方案：

3、一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

4、(1)制备串联体目标片段

5、1.1调取合成feld1 ch1，ch2和linker基因序列，序列分别为seq id no.1、seq idno.2、seq id no.3；

6、1.2融合连接pcr，获得ch2-c4bpα-ch1串联体目标片段，序列为seq id no.4；

7、(2)构建表达载体

8、1.1扩增酶切位点目标片段；

9、1.2pcdna3.1(+)质粒双酶切，连接目标片段；

10、(3)蛋白表达

11、连接产物加入到top10感受态细胞中培养，收取菌体，提取质粒；

12、(4)ch2-c4bpα-ch1基因转染hek293细胞，表达，纯化

13、(5)elisa效价。

14、优选的，所述步骤(2)以质粒pcdna3.1(+)为载体构建表达载体。

15、优选的，所述步骤(3)加入到top10感受态细胞中，冰浴。

16、优选的，所述步骤(3)中的培养采用lb-ag液体培养基。

17、优选的，所述步骤(4)中的纯化采用镍柱进行亲和层析。

18、第二方面，本申请提供一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白，采用如下的技术方案：

19、所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白，其氨基酸序列为：

20、rgavavtagvkmatcydvavangndstkvnatrtamkkdcyvngsrvdgvmttssskdcmgavntvdkntgrmlgsqsiscsesgtwypevprceqeasedlkpaltgmdaactvaatadccavkrdvdtgtdyvvaykavvnarkncvdakmtdknasdkytsc。

21、优选的，构型是蝴蝶状的双链二聚体。

22、第三方面，本申请提供一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的用途，采用如下的技术方案：

23、所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白在制备猫过敏检测试剂盒中的用途。

24、本发明以c4结合蛋白(c4bp)为基础开发多聚体的结构框架。c4bp是a血浆糖蛋白，由6-7条相同的α-链组成，α-链的c端残基为541-597。c4bp-α含有2个半胱氨酸残基和一个两亲体α-螺旋区，由于其自组装能力和独特的结构，通过发生1：1的二硫键配对，能够形成天然状态双链二聚体构象。

25、综上所述，本申请具有以下有益效果：

26、1、本申请将医学过敏原检测原料从复杂的天然提取变为快速，简洁，稳定的重组表达，并且获得与天然构象十分相似的目标蛋白。

27、2、明确的过敏原组分检测是天然提取物很难做到的，使用本申请的重组蛋白的检测结果更加准确，稳定，更好的作为临床疫苗应用的伴随诊断。

28、说明书附图

29、图1：分子克隆条带；

30、图2：涂板结果；

31、图3：蛋白表达sds-page还原电泳；

32、图4：效价验证；

33、图5：临床检测结果图；

34、图6：本申请方法流程图。

技术特征：

1.一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）以质粒pcdna3.1(+)为载体构建表达载体。

3.根据权利要求1所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）加入到top10感受态细胞中，冰浴，再培养。

4.根据权利要求1所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的培养采用lb-ag液体培养基。

5.根据权利要求1所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中的纯化采用镍柱进行亲和层析。

6.权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白，其氨基酸序列为：

7.根据权利要求6所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白，其特征在于：构型是蝴蝶状的双链二聚体。

8.权利要求6所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白在制备猫过敏检测试剂盒中的用途。

技术总结
本申请涉及重组蛋白技术领域，具体公开了一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白、制备方法及应用。先调取合成feld1 ch1，ch2和Linker基因序列，再融合连接PCR，之后以质粒pcDNA3.1(+)为载体构建表达载体，连接产物加入到TOP10感受态细胞中培养，收取菌体，提取质粒，基因转染HEK293细胞，表达，纯化，ELISA效价。本申请方法把复杂的天然提取变为快速，简洁，稳定的重组表达，并且获得与天然构象十分相似的目标蛋白，提高了过敏原的检测准确性。

技术研发人员：黄宁,于清华,李滨雁
受保护的技术使用者：山东立菲生物产业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16