重组表达载体及其应用

本发明属于水稻培育，具体涉及一种重组表达载体及其应用。

背景技术：

1、水稻是我国的三大主要粮食作物之一，对于农业生产和保障国家的粮食安全具有重要的意义。而在实际生产过程中，由于养分、水分等的不足会导致作物减产。氮(nitrogen，n)和磷(phosphorus，p)是植物生长发育所必需的大量营养元素，由于土壤中存在的金属离子的螯合和微生物的固定，导致土壤中的磷的有效性很低。因此通过改善水稻的氮磷营养状况，提高水稻产量，对于保障国家的粮食安全意义重大。

2、nh4+和no3-是土壤中无机氮的主要存在形式，能够被植物直接吸收利用。研究表明，植物根系吸收硝酸盐时会提高根际的ph，吸收铵盐时则会释放h+，从而降低根际ph并酸化土壤；土壤中的磷素由于移动性很差，一直是制约农业生产的主要因素之一。如何改善植物的氮磷营养，一直是植物养分高效利用领域研究的重点。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明目的在于提供一种重组表达载体及其应用，该重组表达载体用于水稻培育中，可以在低磷和正常磷环境中，明显改善水稻生长，显著增加各个部位的氮磷含量，并能增加水稻产量。

2、为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：

3、本发明一方面提供了一种重组表达载体，至少包括如seq id no.1和osamt1.1基因序列。

4、具体地，植物本身改善磷营养状况的途径之一就是通过释放有机酸等酸化土壤，使被固定的磷释放出来，从而能够被根系吸收利用。因此本发明希望通过增加水稻nh4+的吸收，酸化根际土壤，从而能够提高土壤中磷的有效性，最终实现氮磷吸收的双高效。已有研究表明水稻高亲和铵转运蛋白基因osamt1.1在低铵和高铵营养条件下均能够转运nh4+，因此可以作为增加土壤中nh4+吸收的潜在基因。而hoque等(2006)和ranathunge等(2014)的研究发现，水稻中过量表达osamt1.1基因在高铵营养条件下会导致铵中毒，使水稻生长矮小。因此想要通过找到合适的启动子驱动osamt1.1基因的表达，能够在一定范围内增加nh4+吸收的同时避免过量吸收引起nh4+中毒症状，通过增加nh4+的吸收，释放更多的h+离子酸化土壤，进而增加磷的吸收。

5、经研究探索，含有水稻缺磷响应基因ospt6的启动子，即如seq id no.1的序列能够驱动osamt1.1基因合理表达，能够在一定范围内增加nh4+的吸收同时避免过量吸收引起nh4+中毒症状，通过增加nh4+的吸收，释放更多的h+离子酸化土壤，进而增加磷的吸收。

6、进一步地，上述osamt1.1基因序列可以包含如seq id no.2所示的序列。具体地，上述重组质粒载体至少包括如seq id no.1的序列，用于驱动osamt1.1基因的表达，osamt1.1基因序列优选为如seq id no.2所示的序列。

7、进一步地，所述重组表达载体中表达载体可以选择ptck303质粒载体、ti质粒载体、ri质粒载体和植物病毒载体中任一种。具体地，重组表达载体中表达载体可以让目的基因有效的在机体内进行表达，对于本发明的目的基因，优选ptck303质粒载体、ti质粒载体、ri质粒载体和植物病毒载体中任一种，可以有效提高目的基因的稳定表达。

8、进一步地，上述重组质粒载体还包括增强子和/或报告基因。具体地，上述重组质粒载体为了提高如seq id no.1的序列驱动osamt1.1基因的表达，可以连接增强子；为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化或发光来识别的化合物的酶类，比如重组质粒载体增加报告基因。

9、进一步地，所述增强子可以为转录增强子或翻译增强子。

10、进一步地，所述报告基因可以为抗生素抗性基因、gus报告基因和荧光素酶报告基因中任一种。

11、本发明另一方面提供了一种上述的重组表达载体在提高水稻氮磷含量中的应用。

12、本发明另一方面提供了一种上述的重组表达载体在促进水稻生长中的应用。

13、本发明另一方面提供了一种上述的重组表达载体在提高水稻产量中的应用。

14、进一步地，上述应用中，可以将上述重组表达载体通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化水稻，使得水稻可以在低磷或正常磷环境下，增加植株氮磷含量，促进水稻的生长，提高产量。

15、本发明另一方面提供了一种转基因水稻的培育方法，将上述的重组表达载体通过农杆菌介导法、基因枪法或花粉管通道法转到水稻进行培育。

16、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

17、(1)本发明提供的重组质粒载体培养的水稻转基因株系可以在磷营养供应不足条件下改善水稻苗期的生物量，与野生水稻相比，转基因株系的根重和地上部干重分别增加了4.0％-15.2％和4.3％-9.2％。

18、(2)本发明提供的重组质粒载体培养的水稻转基因株系在低磷与正常供磷土壤条件下可以明显改善水稻生长，显著增加各个部位的氮磷含量，与野生型wt相比，转基因株系地上部(包含旗叶、倒二叶、倒三叶和茎秆)干重、氮含量与磷含量分别增加了9.6％-14.6％、18.9％-27.7％、13.9％-24.5％和12.7％-23.0％、22.1％-28.3％、25.4％-30.8％。

19、(3)本发明提供的重组质粒载体培养的水稻转基因株系与野生型wt相比，转基因株系的有效分蘖、单株产量和籽粒氮磷浓度均显著增加，其有效分蘖数增加了13.6％-30.9％，单株产量增加了14.1％-25.8％，籽粒氮磷浓度分别增加了15.7％-18.0％和15.4％-24.3％。

技术特征：

1.重组表达载体，其特征在于，包括如seq id no.1和osamt1.1基因序列。

2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述osamt1.1基因序列包含如seqid no.2所示的序列。

3.根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中表达载体选择ptck303质粒载体、ti质粒载体、ri质粒载体和植物病毒载体中任一种。

4.根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于，还包括增强子和/或报告基因。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述增强子为转录增强子或翻译增强子。

6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述报告基因为抗生素抗性基因、gus报告基因和荧光素酶报告基因中任一种。

7.权利要求1至6中任一项所述的重组表达载体在提高水稻氮磷含量中的应用。

8.权利要求1至6中任一项所述的重组表达载体在促进水稻生长中的应用。

9.权利要求1至6中任一项所述的重组表达载体在提高水稻产量中的应用。

10.一种转基因水稻的培育方法，其特征在于，将权利要求1至6中任一项所述的重组表达载体通过农杆菌介导法、基因枪法或花粉管通道法转到水稻进行培育。

技术总结
本发明属于水稻培育技术领域，具体涉及一种重组表达载体及其应用。该重组表达载体包括如SEQ ID No.1和OsAMT1.1基因序列，其应用在水稻培育中，培育的转基因水稻可以在低磷和正常磷环境中，明显改善水稻生长，显著增加各个部位的氮磷含量，并能增加水稻产量。

技术研发人员：李畅,李广鑫,刘红恩,赵鹏,秦世玉,睢福庆
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16